Forskare från University of Illinois uppnådde den högsta rapporterade frekvensen av att infoga gener i mänskliga celler med CRISPR-Cas9-genredigeringssystemet, ett nödvändigt steg för att utnyttja CRISPR för kliniska genterapiapplikationer.

Genom att kemiskt justera ändarna av det DNA som ska infogas, den nya tekniken är upp till fem gånger effektivare än nuvarande tillvägagångssätt. Forskarna såg förbättringar på olika genetiska platser som testades i en mänsklig njurcellinje, till och med att se 65 % insättning på en plats där den tidigare högsta hade varit 15 %.

Leds av professor i kemi och biomolekylär ingenjör Huimin Zhao, forskarna publicerade sitt arbete i tidskriften Naturens kemiska biologi .

Forskare har funnit att CRISPR är ett effektivt verktyg för att stänga av, eller "slå ut, "en gen. Men i mänskliga celler, det har inte varit ett särskilt effektivt sätt att sätta in eller "knacka in" en gen.

"En bra knock-in-metod är viktig för både genterapiapplikationer och för grundläggande biologisk forskning för att studera genfunktion, sa Zhao, som leder temat biosystemdesign vid Carl R. Woese Institute for Genomic Biology i Illinois. "Med en knock-in-metod, vi kan lägga till en etikett till vilken gen som helst, studera dess funktion och se hur genuttrycket påverkas av cancer eller förändringar i kromosomstrukturen. Eller för genterapiapplikationer, om någon har en sjukdom orsakad av en saknad gen, vi vill kunna sätta in den."

Söker efter ett sätt att öka effektiviteten, Zhaos grupp tittade på 13 olika sätt att modifiera det insatta DNA:t. De fann att små förändringar i slutet av DNA:t ökade både hastigheten och effektiviteten av insättningen.

Sedan, forskarna testade att infoga ändmodifierade DNA-fragment av varierande storlek på flera punkter i genomet, använder CRISPR-Cas9 för att exakt rikta in sig på specifika platser för insättning. De fann att effektiviteten förbättrades två till fem gånger, även när man sätter in större DNA-fragment – ​​den svåraste insättningen att göra.

"Vi spekulerar i att effektiviteten förbättrades så mycket eftersom den kemiska modifieringen till slutet stabiliserar DNA:t vi sätter in, " sa Zhao. "Normalt, när du försöker överföra DNA till cellen, det bryts ned av enzymer som äter bort det från ändarna. Vi tror att vår kemikalietillsats skyddar ändarna. Mer DNA kommer in i kärnan, och att DNA är mer stabilt, så det är därför jag tror att det har en större chans att integreras i kromosomen."

Zhaos grupp använder redan metoden för att märka viktiga gener i genfunktionsstudier. De använde medvetet kemikalier från hyllan för att modifiera DNA-fragmenten så att andra forskarlag kunde använda samma metod för sina egna genetiska studier.

"Vi har utvecklat en hel del knock-in metoder tidigare, men vi tänkte aldrig på att bara använda kemikalier för att öka stabiliteten hos det DNA vi vill infoga, " sa Zhao. "Det är en enkel strategi, men det fungerar."