Gramfärgningen är ett differentialfärgningsförfarande som visar vilka bakterier som är Gram-positiva eller Gram-negativa baserat på deras fläckfärg. Acetonalkohol är ett reagens som används i denna process för att ge färgdifferentiering. Gram-positiva bakterier har ett tjockt peptidoglykanlager och fläckar lila, medan gramnegativa mikroorganismer har ett litet eller inget peptidoglykanlager och fläckrosa.

Primärfärgskristallviolett

En gång en glida av bakterieprovet framställes, kristallviolett används för att fläcka provet först. Vid denna tidpunkt kommer både gram-positiva och gramnegativa bakterier att visas lila. Vanligtvis appliceras kristallvioletten på glidbanan i 30 sekunder innan det tvättas bort eventuellt överskott av fläck med vatten. Kristallviolen kan häfta lite till peptidoglykanskikten så att inte all primär fläck kommer att tvättas bort med vattnet.

Mordant-jod

Jod tillsätts därefter till provet i en minut . Det fungerar som en mordant, som tjänar till att fixa färgämnen i en färgprocess. Jod utför denna funktion genom att binda till kristallviolen och skapa ett olösligt komplex som adheres mycket bättre till det tjocka peptidoglykanskiktet som finns i gram-positiva bakterieceller än bara kristallviolen ensam. Det finns inget tvättsteg med vatten efter tillsats av jod.

Avfärgningsmedel-Alkohol

Endera aceton eller etylalkohol kan användas som avfärgningsmedel. Alkoholen löser upp lipider som finns i det yttre cellmembranet av gramnegativa bakterier, vilket gör att kristallviolett-jodkomplexet kan läcka ut ur det tunnare peptidoglykanskiktet. Alkoholen tillsättes i 10 till 20 sekunder; Det hälls på bilden tills all jod tvättas bort och avrinningen är färglös. Vid denna punkt i Gram-fläckprocessen är Gram-negativa bakterier färglösa medan Gram-positiva bakterier fortfarande behåller kristallviolen. När det är klart, behöver gliden sköljas med vatten för att stoppa avfärgningseffekten.

Counterstain-Safranin

Safranin tillsätts sedan för att öka synligheten och kontrasten mot de färglösa gramnegativa bakterierna. Fläcken gör att dessa bakterier verkar rosa under mikroskopet. Eftersom fläcken läggs till hela provet, fläckar den också gram-positiva bakterier, men den mörkare kristallviolen döljer den ljusare safraninrosa färgen. När glidprovet har översvämmats med safranin i ungefär en minut används vatten för att tvätta bort eventuellt överskott av fläckar som inte höll fast vid bakteriecellerna.