Mikrobiella sekundära metaboliter, de molekyler som inte är nödvändiga för tillväxt men ändå nödvändiga för överlevnad, kan nu vara lättare att karakterisera efter en proof-of-concept-studie där forskare parade ihop CRISPR- och CRAGE-teknologier.

Medan CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) är det ledande verktyget för att exakt redigera genom, har dess effektivitet historiskt sett varit begränsad på grund av bristen på robusta verktyg tillgängliga för att transportera CRISPR in i mikroorganismer. CRAGE (Chassis-oberoende Recombinase-Assisted Genome Engineering) är en teknik som forskare kan använda för att integrera stora genetiska nyttolaster direkt i olika mikrober.

Att kombinera CRAGE med CRISPR ger forskare ett kraftfullt tillägg till deras verktygslåda för att studera genfunktion. Som en demonstration använde forskarna CRAGE-CRISPR för att upptäcka aktiva sekundära metaboliter och hjälpa dem att identifiera och beskriva funktionerna hos de biosyntetiska genkluster som producerar dem.

Sekundära metaboliter är mikrobiella föreningar som produceras som svar på svårigheter eller konkurrens. De utgör grunden för en mängd viktiga produkter inom bioteknik, medicin, jordbruk och andra industrier - men det finns fortfarande så mycket om dem som vi inte vet.

Att låsa upp kraften hos sekundära metaboliter kan vara komplicerat eftersom de BGC som producerar dem inte kan aktiveras i labbmiljöer. CRAGE gjorde en del framsteg med att övervinna detta hinder när det kom till scenen 2019. Nu är den kraften redo att växa exponentiellt genom att kombinera den med CRISPR.

Genom att använda CRAGE är forskare inte längre begränsade till att använda modellvärdmikrober; teoretiskt sett kan vilken mikrob som helst fungera som fabrik för att producera kemiska föreningar av intresse. Genom att använda CRAGE för att domesticera målmikrober kan JGI-användare sedan använda CRISPR i en mängd olika mikrobiella värdar.

Photorhabdus luminescens visar sig vara dödlig för insekter. Den bärs av en smittsam nematod och släpper ut gifter i insektens blodomlopp som snabbt dödar värden. Att förstå exakt hur P. luminescens och dess sekundära metaboliter fungerar kan ge nya verktyg för skadedjursbekämpning.

Sekundära metaboliter är starkt reglerade i bakterier, vilket gör det svårt att identifiera vilken väg som motsvarar vilken metabolit. Att hitta ett medel för att introducera CRISPR i mikroben är nyckeln, eftersom det gör det möjligt för forskare att ta bort eller aktivera vissa gener och bedöma hur dessa redigeringar påverkar funktionaliteten.

CRAGE möjliggör transplantation av dessa BGC från en organism till en alternativ värd via en landningsplatta som består av en cre-rekombinasgen och ömsesidigt exklusiva lox-ställen. I slutändan gör denna process det möjligt för forskare att identifiera stammar som kan producera sekundära metaboliter i en labbmiljö, och lyser in i denna "biologiska mörka materia."

Det erbjuder också CRISPR en ingångspunkt. Genom att använda CRISPR för att slå ut eller aktivera gener kunde forskare vid JGI övervaka förlust- och vinst-of-funktion. Studiens analytiska data visar toppar och dalar i sekundära metaboliter när gener redigeras. Med hjälp av CRAGE visade sig parningen snabbt bekräfta ökad produktion av 22 metaboliter från sex biosyntetiska genkluster. En av dessa var en metabolit från ett tidigare okarakteriserat biosyntetiskt genkluster. Det arbetet av JGI-forskare publicerades april 2022 i Cell Chemical Biology .

När det kommer till insektsdödaren P. luminescens specifikt, kan förståelse av dess sekundära metaboliter och deras vägar underblåsa ytterligare jordbrukstillämpningar för skadedjursbekämpning och förstå hur patogenen använder insekter som bränsle.

Effekten av parningen kan visa sig vara mycket mer långtgående. Kompatibiliteten mellan CRAGE och CRISPR skulle potentiellt kunna göra det möjligt att introducera CRISPR i andra bakterier, och därigenom förbättra forskarsamhällets förståelse för hur sekundära metaboliter produceras och hur man kan utnyttja sina krafter inom jordbruk, läkemedel, biobränslen och vidare. + Utforska vidare

Låsa upp den biokemiska skattkistan i mikrober