Kredit:Kumamoto University
Proteinerna som utgör våra celler håller i en hel värld av information, som, när den är upplåst, kan ge oss insikter om ursprunget till många viktiga biologiska fenomen. Denna information samlas in med hjälp av en analytisk teknik som kallas "encellig proteomik", där en encellsanalys utförs för att observera egenskaperna hos enskilda celler på deras proteinnivå. Under åren har forskare använt encellig proteomik inom cancergenomik, celldifferentiering och vävnadsutveckling. Men nuvarande proteomiktekniker lider av låg återvinningshastighet av proteinprover, låg genomströmning och brist på mångsidighet.
Lyckligtvis har ett team av forskare från Japan och USA under ledning av assisterande professor Takeshi Masuda från Kumamoto University i Japan hittat en lösning på dessa problem. I en nyligen genomförd studie tillgänglig online den 11 juli 2022 och publicerad i Analytical Chemistry den 26 juli 2022 introducerade teamet en enkel men mycket effektiv provberedningsmetod för encellig proteomik som kallas "vattendroppe-i-olja-metoden" (WinO). Tekniken använder sig av oblandbarheten av vatten med olja/organiskt lösningsmedel till sin fördel för att förbereda proteinprover med minimal förlust och ökade chanser till provåtervinning.
"För att göra encellsproteomik mer effektiv måste vi antingen amplifiera proteinprovet eller se till att inget av det går förlorat under provberedningen. Eftersom vi inte hade möjlighet att göra det förra var det avgörande att vi minskade absorptionen förluster under provberedningsstegen som provöverföring," förklarar Dr. Masuda. "WinO-tekniken minskar inte bara provförlusten genom adsorption utan ger också bättre genomströmning jämfört med konventionella metoder."
För WinO-processen förberedde teamet först en extraktionsbuffert genom att blanda en mikroliter vatten med fasöverförande ytaktiva ämnen (som ökar lösligheten av hydrofoba proteiner) och hydrofoba karboxylbelagda nanomagnetiska pärlor. Denna blandning droppades sedan i 50 mikroliter etylacetat.
Nästa steg var proteinextraktion, som utfördes genom att tillsätta celldroppar från cellsorteraren till kombinationen av etylacetat-vattendroppar och snurra den i en centrifug för att låta proteinet ackumuleras i vattendroppen. Efter extraktionen digererades provet med användning av ett proteinenzym, Lys-C, och märktes med ett "tandem mass tag"-reagens. Det extraherade-digererade-märkta provet renades sedan och utvanns för encellsanalys och proteomiska profiler.
För att jämföra effektiviteten av WinO-metoden mot konventionella metoder, förberedde teamet också prover med standardmetoden för uppslutning i lösning (ISD) och utförde proteomisk analys. De fann att WinO-metoden ledde till en tiofaldig ökning av protein- och peptidåtervinning jämfört med ISD. Denna anmärkningsvärda förbättring tillskrevs en minskad kontaktyta mellan extraktionslösningen och provbehållaren.
För att analysera känsligheten för båda metoderna jämförde teamet också de erhållna proteomiska profilerna. De observerade en hög korrelation mellan proteomprofiler erhållna för 100 celler med WinO och det för 10 000 celler med ISD. Dessutom kvantifierade teamet framgångsrikt 462 proteiner med WinO, vilket visade att det gav en mycket högre genomströmning och extraktionseffektivitet än konventionella tekniker.
Den förbättrade proteinåtervinningen och identifieringsförmågan som WinO tillhandahåller kan möjliggöra en närmare titt på proteinuttrycket av cancerceller och en bättre förståelse av mekanismerna bakom anticancerläkemedelsresistens. Vidare kan WinO halvautomatiseras med hjälp av en vätskehanteringsrobot, vilket gör den lämplig för höghastighetsbehandling med stor kapacitet av prover. "Vår forskning kan tillåta forskare att utföra proteomik på sällsynta och begränsade provmängder samt ge ett nytt perspektiv på proteinuttryck, vilket öppnar upp möjligheter för att upptäcka nya biologiska fenomen", avslutar Dr. Masuda. + Utforska vidare
