Vad du än gör, vare sig det är att köra bil, ta en joggingtur eller till och med när du är som mest lat, äta chips och titta på TV i soffan, finns det en hel svit av molekylärt maskineri inuti var och en av dina celler som jobbar hårt. Det maskineriet, alldeles för litet för att se med blotta ögat eller till och med med många mikroskop, skapar energi till cellen, tillverkar dess proteiner, gör kopior av dess DNA och mycket mer.

Bland dessa maskiner, och en av de mest komplexa, finns något som kallas kärnporkomplexet (NPC). NPC, som är gjord av mer än 1 000 individuella proteiner, är en otroligt särskiljande gatekeeper för cellens kärna, den membranbundna regionen inuti en cell som håller den cellens genetiska material. Allt som går in eller ut ur kärnan måste passera genom NPC på sin väg.

NPC:s roll som gatekeeper av kärnan betyder att den är avgörande för cellens verksamhet. Inom kärnan kopieras DNA, cellens permanenta genetiska kod, till RNA. Det RNA förs sedan ut ur kärnan så att det kan användas för att tillverka de proteiner som cellen behöver. NPC säkerställer att kärnan får de material den behöver för att syntetisera RNA, samtidigt som den skyddar DNA från den hårda miljön utanför kärnan och gör det möjligt för RNA att lämna kärnan efter att den har tillverkats.

"Det är lite som en flygplanshangar där man kan reparera 747:or, och dörren öppnas för att låta 747:an komma in, men det står en person där som kan hindra en enda kula från att komma ut medan dörrarna är öppna", säger Caltechs André Hoelz, professor i kemi och biokemi och fakultetsforskare vid Howard Hughes Medical Institute. I mer än två decennier har Hoelz studerat och dechiffrerat strukturen hos NPC i förhållande till dess funktion. Under årens lopp har han stadigt slängt iväg på dess hemligheter och avslöjat dem bit för bit för bit.

Konsekvenserna av denna forskning är potentiellt enorma. NPC är inte bara central för cellens verksamhet, den är också involverad i många sjukdomar. Mutationer i NPC är ansvariga för vissa obotliga cancerformer, för neurodegenerativa och autoimmuna sjukdomar såsom amyotrofisk lateralskleros (ALS) och akut nekrotiserande encefalopati, och för hjärtsjukdomar inklusive förmaksflimmer och tidig plötslig hjärtdöd. Dessutom riktar sig många virus, inklusive det som är ansvarigt för covid-19, mot och stänger av NPC under deras livscykel.

Nu, i ett par artiklar publicerade i tidskriften Science , beskriver Hoelz och hans forskargrupp två viktiga genombrott:bestämningen av strukturen hos den yttre ytan av NPC och förtydligandet av mekanismen genom vilken speciella proteiner fungerar som ett molekylärt lim för att hålla ihop NPC.

Ett mycket litet 3D-pussel

I sin uppsats med titeln "Architecture of the cytoplasmic face of the nuclear pore," Hoelz och hans forskargrupp beskriver hur de kartlade strukturen på sidan av NPC som är vänd utåt från kärnan och in i cellernas cytoplasma. För att göra detta var de tvungna att lösa motsvarigheten till ett mycket litet 3D-pussel, med hjälp av avbildningstekniker som elektronmikroskopi och röntgenkristallografi på varje pusselbit.

Stefan Petrovic, doktorand i biokemi och molekylär biofysik och en av de första författarna till artiklarna, säger att processen började med Escherichia coli-bakterier (en bakteriestam som vanligtvis används i laboratorier) som var genetiskt framställda för att producera de proteiner som utgör den mänskliga NPC.

"Om du går in i labbet kan du se den här gigantiska väggen av kolvar där kulturer växer", säger Petrovic. "Vi uttrycker varje enskilt protein i E. coli-celler, bryter upp dessa celler och renar kemiskt varje proteinkomponent."

När den reningen – som kan kräva så mycket som 1 500 liter bakteriekultur för att få tillräckligt med material för ett enda experiment – ​​var klar, började forskargruppen mödosamt testa hur delarna av NPC:n passade ihop.

George Mobbs, senior postdoktoral forskare i kemi och en annan medförsta författare till uppsatsen, säger att monteringen skedde på ett "stegvis" sätt; i stället för att hälla alla proteiner tillsammans i ett provrör samtidigt, testade forskarna par av proteiner för att se vilka som skulle passa ihop, som två pusselbitar. Om ett par hittades som passade ihop, skulle forskarna sedan testa de två nu kombinerade proteinerna mot ett tredje protein tills de hittade ett som passade med det paret, och sedan testades den resulterande tredelade strukturen mot andra proteiner, och så på. Att arbeta sig igenom proteinerna på detta sätt gav så småningom det slutliga resultatet av deras papper:en 16-proteinkil som upprepas åtta gånger, som skivor av en pizza, för att bilda ansiktet på NPC.

"Vi rapporterade den första fullständiga strukturen av hela cytoplasmatiska ansiktet av den mänskliga NPC, tillsammans med rigorös validering, istället för att rapportera en serie av stegvisa framsteg av fragment eller delar baserat på partiell, ofullständig eller lågupplöst observation", säger Si Nie , postdoktoral forskarassistent i kemi och även en av de första författare till uppsatsen. "Vi bestämde oss för att tålmodigt vänta tills vi hade skaffat all nödvändig information och rapporterade en enorm mängd ny information."

Deras arbete kompletterade forskning utförd av Martin Beck från Max Planck Institute of Biophysics i Frankfurt, Tyskland, vars team använde kryo-elektrontomografi för att generera en karta som gav konturerna av ett pussel i vilket forskarna var tvungna att placera bitarna. För att påskynda slutförandet av pusslet med den mänskliga NPC-strukturen utbytte Hoelz och Beck data för mer än två år sedan och byggde sedan oberoende strukturer av hela NPC. "Den avsevärt förbättrade Beck-kartan visade mycket tydligare var varje del av NPC - för vilken vi bestämde atomstrukturerna - måste placeras, i likhet med en träram som definierar kanten på ett pussel," säger Hoelz.

De experimentellt bestämda strukturerna för NPC-delarna från Hoelz-gruppen tjänade till att validera modelleringen av Beck-gruppen. "Vi placerade strukturerna på kartan oberoende av varandra, med olika tillvägagångssätt, men de slutliga resultaten överensstämde helt. Det var mycket tillfredsställande att se det", säger Petrovic.

"Vi byggde ett ramverk på vilket många experiment nu kan göras", säger Christopher Bley, en senior postdoktoral forskarassistent i kemi och även medförfattare. "Vi har den här sammansatta strukturen nu, och den möjliggör och informerar framtida experiment om NPC-funktion, eller till och med sjukdomar. Det finns många mutationer i NPC som är förknippade med fruktansvärda sjukdomar, och att veta var de är i strukturen och hur de kommer tillsammans kan hjälpa till att utforma nästa uppsättning experiment för att försöka svara på frågorna om vad dessa mutationer gör."

'Detta eleganta arrangemang av spaghetti-nudlar'

I den andra artikeln, med titeln "Arkitecture of the linker-scaffold in the nuclear pore", beskriver forskargruppen hur den bestämde hela strukturen av det som är känt som NPC:s linker-ställning – samlingen av proteiner som hjälper till att hålla ihop NPC:n samtidigt som den ger den den flexibilitet den behöver för att öppna och stänga och anpassa sig för att passa molekylerna som passerar igenom.

Hoelz liknar NPC:n med något byggt av legoklossar som passar ihop utan att låsa ihop sig och istället surras ihop av gummiband som håller dem mestadels på plats samtidigt som de låter dem röra sig lite.

"Jag kallar dessa ostrukturerade limbitar för "porens mörka materia", säger Hoelz. "Detta eleganta arrangemang av spaghetti nudlar håller ihop allt."

Processen för att karakterisera strukturen hos länkställningen var ungefär densamma som den process som användes för att karakterisera de andra delarna av NPC. Teamet tillverkade och renade stora mängder av de många typerna länk- och ställningsproteiner, använde en mängd olika biokemiska experiment och bildtekniker för att undersöka individuella interaktioner och testade dem bit för bit för att se hur de passar ihop i den intakta NPC.

För att kontrollera deras arbete, introducerade de mutationer i generna som kodar för vart och ett av dessa länkproteiner i en levande cell. Eftersom de visste hur dessa mutationer skulle förändra de kemiska egenskaperna och formen av ett specifikt länkprotein, vilket gör det defekt, kunde de förutsäga vad som skulle hända med strukturen av cellens NPC:er när de defekta proteinerna introducerades. Om cellens NPC:er var funktionellt och strukturellt defekta på det sätt de förväntade sig, visste de att de hade det korrekta arrangemanget av länkproteinerna.

"En cell är mycket mer komplicerad än det enkla system vi skapar i ett provrör, så det är nödvändigt att verifiera att resultat från in vitro-experiment håller i sig in vivo", säger Petrovic.

Sammansättningen av NPC:s yttre yta hjälpte också till att lösa ett långvarigt mysterium om kärnvapenhöljet, det dubbla membransystemet som omger kärnan. Liksom membranet i cellen där kärnan finns, är kärnmembranet inte helt slätt. Snarare är den översållad med molekyler som kallas integrala membranproteiner (IMP) som fungerar i en mängd olika roller, inklusive att fungera som receptorer och hjälpa till att katalysera biokemiska reaktioner.

Även om IMP kan hittas på både insidan och utsidan av kärnkraftshöljet, hade det varit oklart hur de faktiskt reste från den ena sidan till den andra. Faktum är att eftersom IMP:er har fastnat inuti membranet, kan de inte bara glida genom den centrala transportkanalen i NPC, precis som fritt flytande molekyler.

När Hoelz team förstod strukturen av NPC:s länkställning, insåg de att det möjliggör bildandet av små "rännor" runt dess ytterkant som gör att IMP:erna kan glida förbi NPC från ena sidan av kärnvapenhöljet till den andra medan förblir alltid inbäddad i själva membranet.

"Det förklarar många saker som har varit gåtfulla på området. Jag är mycket glad över att se att den centrala transportkanalen verkligen har förmågan att vidga och bilda sidoportar för dessa IMP, som vi ursprungligen föreslog för mer än ett decennium sedan , säger Hoelz.

Sammantaget representerar resultaten av de två artiklarna ett steg framåt i forskarnas förståelse av hur den mänskliga NPC är uppbyggd och hur den fungerar. Teamets upptäckter öppnar dörren för mycket mer forskning. "Efter att ha bestämt dess struktur kan vi nu fokusera på att utarbeta de molekylära baserna för NPC:s funktioner, till exempel hur mRNA exporteras och de underliggande orsakerna till de många NPC-associerade sjukdomarna med målet att utveckla nya terapier," säger Hoelz.

Uppsatserna som beskriver arbetet finns i numret av den 10 juni av tidskriften Science . + Utforska vidare

Biokemister löser strukturen hos cellens DNA-portvakt