När seniorforskaren Jonathan Grimm kom till Janelia för 13 år sedan visste han inte mycket om fluorescens eller fluorescerande färgämnen. Men som en organisk kemist som hade arbetat med läkemedelsupptäckt på Merck, visste han verkligen ett och annat om medicinsk kemi.
På ett infall bestämde sig Grimm och Janelia Senior Group Leader Luke Lavis för att försöka använda en stöttepelare läkemedelskemi-reaktion Grimm hade plockat upp i läkemedelsindustrin för att förbättra flera hundra år gammal färgkemi. De trodde att detta tillvägagångssätt kunde ge tillgång till helt nya, tidigare otillgängliga rhodaminer – molekyler som Lavis hade arbetat med att göra ljusare och mer hållbara så att de kunde användas för att bättre avbilda celler under kraftfulla mikroskop.
Resultatet blev starten på vad som skulle bli de nu allmänt förekommande och oumbärliga Janelia Fluor-färgämnena, ljusa, fotostabila, cellgenomsläppliga fluorescerande sonder som gör att biologer kan se molekylerna inuti cellerna. Mer än ett decennium efter att de först avslöjades har dessa fluorescerande färgämnen som spänner över färgspektrumet blivit en stapelvara i biologiska laboratorier över hela världen.
Med ett liknande tillvägagångssätt har Grimm, Lavis och deras medarbetare nu släppt kulmen på sina år av arbete i Journal of the American Chemical Society :en omfattande samling av ytterligare rhodaminbaserade fluorescerande färgämnen – en helt ny uppsättning av långt rödskiftade färgämnen som kan penetrera djupare in i vävnaden och är bra för in vivo-avbildning, vilket gör dem mycket viktiga för biologer.
Teamet delade också med sig av sitt tillvägagångssätt – den nya kemin som de utvecklade för att syntetisera färgämnen och insikter som ger en färdplan för att designa framtida sonder.
"Längs vägen tillämpade eller modifierade vi eller kom på helt nya sätt att göra rhodaminer som har en ganska bred räckvidd, och som gjorde det möjligt för oss att göra så många färgämnen relativt snabbt," säger Grimm. "Det här är förmodligen det mest omfattande arbetet vi har gjort med rhodaminer hittills."
Det senaste projektet startade i början av covid-19-pandemin i början av 2020. Teamet hade precis släppt forskning som beskriver den nya kemin de använde för att utöka Janelia Fluor-färgämnespaletten.
Därefter ville de se om de kunde tillämpa det de lärt sig om att optimera Janelia Fluor-färgämnen på andra typer av rhodaminbaserade färgämnen samtidigt som de ytterligare förbättrade kemin som användes för att syntetisera dem.
När världen stängdes av planerade Grimm och Lavis ny kemi – inklusive helt nya kemiska reaktioner – som försökte rationellt införliva lärdomarna från Janelia Fluor-färgämnena i andra klassiska men suboptimala rhodaminer.
Några månader senare gick Grimm tillbaka till labbet och började se om deras arbete på papper kunde översättas till den verkliga - och ibland oförutsägbara - världen av organisk kemi. Med covid-förebyggande åtgärder på plats arbetade Grimm ensam i labbet, optimerade kemin och skapade de första nya färgämnena.
"Det skulle förmodligen ha hänt ändå, men på gott och ont, när det inte finns något annat att fokusera på, eller saker att fokusera på var dåliga - som 2020 var för alla - var kemin en trevlig distraktion", säger Grimm.
Den nya forskningen visar kulmen på lagets arbete under de senaste tre åren. Till skillnad från de traditionella Janelia Fluor-färgämnena, som kännetecknas av ett bihang som kallas en azetidinring, har de andra rhodaminbaserade färgämnena olika substituenter som sticker ut från andra delar av deras molekylära strukturer.
Beväpnad med kunskap från optimering av JF-färgämnen modifierade teamet dessa andra områden på de äldre rhodaminfärgämnena för att ändra deras färg, ljusstyrka, fotostabilitet, cellpermeabilitet och andra egenskaper.
Resultatet är en helt ny uppsättning rhodaminbaserade färgämnen för bildbehandling. Teamet kunde också ta fram flera nya sätt att göra klassiska rhodaminfärgämnen, vilket gjorde det möjligt för dem att skapa dussintals funktionella versioner relativt snabbt.
"Vi hade länge vetat hur en förändring av funktionaliteten på "toppen" av molekylen påverkar färgerna på fluoroforerna, men vi kom också på att detta starkt påverkar färgämnets kemiska egenskaper, säger Lavis. "Vi utnyttjade det på olika sätt för att göra ljusa, rödskiftade bildbehandlingsmedel."
Även om detta inte är slutet på historien för rhodaminfärgämnen, går arbetet troligen i en annan riktning. Nu fokuserar teamet på att designa reagenser som är speciellt skräddarsydda för användning av deras biologsamarbetspartner, och arbetar för att bygga de allra bästa verktygen de kan med den kunskap de har fått.
"Vi kan göra vilket rhodaminfärgämne vi någonsin vill ha med den här kemin, och så den stora frågan är vad vi gör härnäst", säger Lavis. "Det är inte vad vi kan göra utan vad vi ska göra."
Grimm säger att utvecklingen av denna expansiva uppsättning rhodaminer, som tog över ett decennium, är ett bevis på HHMI Janelias stöd för långsiktiga ansträngningar som är fördelaktiga för det bredare forskarsamhället. Genom att ha fast anställda forskartjänster på Janelia kan Grimm och andra seniora forskare också ge kontinuitet till ett stort projekt som Janelia Fluor färgämnen. Fyra av forskarna på den senaste publikationen var också på det allra första rhodaminefärgpapperet som labbet publicerade 2011.
För Grimm betyder det också att han får göra det han älskar – vara i labbet, göra kemi och skapa verktyg som är användbara för biologer. Och mer än 13 år senare har han också lärt sig ett och annat om fluorescerande färgämnen.
"Det är mycket tillfredsställande att ha den här tidslinjen med papper som visar allt vi har gjort under åren, och det hela började med bara en slumpmässig reaktion baserad på en liten beräkning som Luke gjorde, som i sig möjliggjordes av en syntetisk metod som vi råkade helt enkelt fortsätta, på ett infall, helt enkelt för att göra färgsyntesen lite lättare, säger Grimm. "Även om en beräkning ser bra ut, blir den inte alltid på det sättet. I det här fallet var den död på, och det lönade sig verkligen."
Mer information: Jonathan B. Grimm et al, Optimized Red-Absorbing Dyes for Imaging and Sensing, Journal of the American Chemical Society (2023). DOI:10.1021/jacs.3c05273
Journalinformation: Tidskrift för American Chemical Society
Tillhandahålls av Howard Hughes Medical Institute
