Noggranna mätningar av ljusintensiteten ger viktiga data för forskare och vardagliga applikationer. Exakta värden hjälper till exempel att optimera mikroskopisignaler, utlösa fysiologiska processer i hjärnan och driva ljusabsorberande reaktioner samtidigt som de gör det möjligt för olika forskarlag att dela och reproducera experimentella resultat.
"Nu för tiden är en stor grupp av biologer, kemister, ingenjörer och fysiker angelägna om att leverera exakta antal fotoner", förklarar en forskargrupp vars arbete just har publicerats i Nature Methods . I en större skala är precision också avgörande för kritiska uppgifter som vattenrening och fototerapeutik.
Men de flesta tillvägagångssätt saknar mångsidighet och användbarhet. Till exempel kan de flesta metoder inte kvantifiera ljusintensitet och rumsfördelning samtidigt eller kan bara göra det över ett begränsat intervall av ljusvåglängder och intensiteter.
För att tillhandahålla ett mångsidigt alternativ till begränsningarna av nuvarande tillvägagångssätt, utvecklade forskargruppen två kompletterande protokoll med hjälp av nya aktinometrar - fysiska eller kemiska system som kan kvantifiera fotoner. Eftersom de är flytande lösningar kan aktinometrar användas i prover av olika former och storlekar. Ändå är de flesta inte särskilt exakta eller kompatibla med bildsystem och är vanligtvis begränsade till specifika våglängder och ljusintensiteter.
För att övervinna dessa begränsningar använde teamet fluorescensbaserade aktinometrar, som visade sig vara snabbare, känsligare och kunna tillhandahålla data som är mer tillgänglig för bildbehandlingssystem.
Det första protokollet använder fem molekylära aktinometrar – som täcker hela spektrumet av ultraviolett och synligt ljus – som avger fluorescerande signaler när de absorberar excitationsljuset som forskarna vill mäta. Under vissa förhållanden kan detta protokoll också kartlägga den rumsliga fördelningen av ljusintensiteten. Teamet testade flera typer av aktinometrar, från syntetiska kemikalier för kemister till proteiner och fotosyntetiska organismer för biologer.
"Vi ville göra fluorescerande aktinometrar tillgängliga för olika grupper av slutanvändare", säger forskarna.
Det andra protokollet kompletterar de fluorescerande aktinometrarna i den första, eftersom på grund av deras begränsade ljusabsorptionsintervall behövs flera aktinometrar för att täcka hela våglängdsområdet. Det här protokollet använder en stabil fluorofor – en kemikalie som kan återutsända ljus vid ljusexcitation – för att återkalkylera ljusintensiteten från en våglängd till en annan.
"Tillsammans kan de två nya protokollen användas i svagt ljus, kortare perioder och ett bredare våglängdsområde än konventionella metoder", bekräftar gruppen.
Forskargruppen tillämpade framgångsrikt protokollen för att karakterisera den rumsliga fördelningen av ljus i olika fluorescensbildsystem, vilket visar deras mångsidighet och noggrannhet. Protokollen har också använts för att kalibrera belysning i kommersiellt tillgängliga instrument och ljuskällor.
Dessa protokoll kan användas i bredfälts- och konfokalmikroskopi, vilket möjliggör exakt mätning av ljusintensiteten i biologiska prover. Teamet säger:"Vi föreställer oss att [våra protokoll] kommer att förbättra vår förståelse för hur ljus påverkar hälsan och livsdugligheten hos biologiska prover." Även komplexa miljöer kan studeras, som i geler eller djupt inne i vävnader, en väsentlig egenskap för DREAM i sitt uppdrag att registrera dynamiken i fotosyntesreglering i mikroalger eller växter.
Att introducera dessa fluorescensbaserade aktinometrimetoder representerar ett betydande steg framåt för att noggrant mäta ljusintensiteten. Med online-åtkomst till aktinometeregenskaper och användarvänliga databehandlingsapplikationer bör forskare och ingenjörer nu vara utrustade för att noggrant mäta ljusintensitet och dela tillförlitlig och reproducerbar data mellan olika discipliner.
Mer information: Aliénor Lahlou et al, Fluorescens för att mäta ljusintensitet, Naturmetoder (2023). DOI:10.1038/s41592-023-02063-y
Journalinformation: Naturmetoder
Tillhandahålls av INsociety
