Negativ färgningsmetod. (a) Virioner är fästa på kolbärarfilmen. (b) En lösning som innehåller tungmetaller (negativt färgningsreagens) droppas på filmen. (c) Överskottslösning avlägsnas och provet torkas. (d) Transmissionselektronmikroskopi (TEM) av tungmetallbelagda virioner ger (e) en omvänd kontrastbild av viruset. Kredit:Koichi Sahiro et al, Scientific Reports (2022). DOI:10.1038/s41598-022-11405-3
Att se är att tro – eller, för forskare, början på förståelse. Forskare kan visualisera atomärt små detaljer med transmissionselektronmikroskopi (TEM) genom att stråla elektroner genom provet och fånga deras interaktioner för att bilda en bild. Men sådana små exemplar kan undvika elektronerna, så de måste specialbehandlas med tungmetaller för att säkerställa interaktioner. För att se virus, till exempel, är den nuvarande standarden att skölja virusprovet med en lösning som innehåller ett radioaktivt, hårt kontrollerat ämne som kallas uranylacetat.
De resulterande bilderna är tydliga, men processen att anskaffa och lagra den radioaktiva tungmetalllösningen som krävs kan vara en komplicerad barriär för forskare, enligt Masahiro Sadakane, professor i tillämpad kemi vid Hiroshima Universitys Graduate School of Advanced Science and Engineering. Sadakane och hans team fann nyligen att en icke-radioaktiv behandling kan producera samma tydliga, detaljerade bilder utan uranylacetats byråkratiska krångel.
De publicerade sina resultat den 12 maj i Scientific Reports .
"Att observera viral morfologi är väsentligt inom virologi, för vilken TEM är den mest använda tekniken eftersom den tillåter direkt visualisering på nanometerskala, men det kräver för närvarande tunga elementinnehållande negativa färgningsreagenser", säger Sadakane, motsvarande författare på tidningen. "Nya, icke-radioaktiva föreningar för enkla, snabba och tydliga observationer med traditionell TEM behövs över hela världen."
Ett för närvarande kommersiellt tillgängligt alternativ till det radioaktiva uranylacetatet är ett material känt som "Keggin-typ" fosfovolframsyra. Molekylen består av en central enhet av ett fosfat och fyra syreämnen, tätt omgivna av volfram och mer syre. Även om den inte är radioaktiv, är molekylen mycket sur och måste neutraliseras före användning, enligt Sadakane. Han noterade också att bilderna som den producerar är mindre tydliga än de som är gjorda med uranylacetat. Men trots dessa nackdelar tillhör reagenset en stor familj av liknande – och möjligen bättre – föreningar.
"Vi har undersökt fosfowolframatföreningar och tidigare rapporterat att "Preyssler-typen" kan användas som ett negativt färgningsreagens för att observera en fin struktur hos bakterier, säger Sadakane.
"Molekyler av Preyssler-typ innehåller också volfram, syre och fosfat, men de är strukturellt arrangerade runt en inkapslad positivt laddad jon, såsom natrium eller kalcium. De har en annan struktur än föreningarna av Keggin-typ, vilket resulterar i en mycket mer stabil molekyl. som produceras som ett kaliumsalt."
Forskarna använde fosfowolframater av Preyssler-typ för att färga och avbilda tre typer av bakterievirus (fager) som infekterar bakterier. De morfologiska strukturerna hos dessa fager är redan väldokumenterade och ger en tillförlitlig referens för att kontrollera klarheten hos bilder som erhållits i deras studie.
"Våra resultat indikerar att fosfowolframater av Preyssler-typ är bra negativt färgande reagenser för virusobservationer," sa Sadakane. "De är lätta att använda, eftersom de inte är radioaktiva och inte behöver justeras för pH-nivåer, och de ger tydliga bilder."
Forskarna planerar att bygga vidare på sina resultat för att utveckla en serie icke-radioaktiva negativt färgande reagenser för att observera andra virus, såväl som små organiska partiklar som proteiner och mer, enligt Sadakane. + Utforska vidare
