Av Tricia Lobo, uppdaterad 30 augusti 2022
Enzymer påskyndar kemiska reaktioner genom att sänka aktiveringsenergin. De flesta enzymer presterar bäst mellan 35°C och 40°C, ett område där ökad kinetisk energi förbättrar substratbindningen utan att orsaka denaturering. Att överskrida detta fönster kan irreversibelt utveckla proteinet och stoppa aktiviteten.
Välj en pålitlig metod för att kvantifiera produktbildning vid varje temperaturpunkt. Vanliga alternativ inkluderar spektrofotometri – omvandling av absorbans till koncentration med hjälp av en kalibreringskurva – eller fluorescensanalyser som korrelerar intensitet med produktmängd.
Kombinera enzym och substrat i en förseglad scintillationsflaska för att förhindra avdunstning. Placera flaskan i en större bägare med vatten och montera bägaren på en värmeplatta. Sätt i en kalibrerad termometer i bägaren för att noggrant övervaka lösningens temperatur.
Börja med att ta en 100‑µL alikvot vid omgivningstemperatur (~25°C). Aktivera värmeplattan och samla in 100‑µL prover vid inkrementella temperaturer – 30,5 °C, 31 °C, 31,5 °C, etc. – tills du når 40 °C. Se till att varje prov bearbetas omedelbart för att undvika temperaturavvikelser.
Bestäm produktkoncentrationen för varje alikvot med hjälp av den valda analysen. Rita koncentration (eller reaktionshastighet) kontra temperatur. Toppen av denna kurva identifierar enzymets optimala temperatur. Temperaturer över 40°C visar vanligtvis en minskning i aktivitet, vilket indikerar början av denaturering.
