Av Pete Collins | Uppdaterad 30 augusti 2022
Elektrofores separerar makromolekyler såsom proteiner och nukleinsyror efter storlek, laddning och andra fysikalisk-kemiska egenskaper. I laddningsbaserade separationer överför en buffertlösning det elektriska fältet och upprätthåller ett stabilt pH, vilket bevarar den naturliga laddningen och strukturen hos analyterna. Denna stabilitet är avgörande för korrekt upplösning.
Elektrofores utnyttjar ett applicerat elektriskt fält (eller en kemisk gradient i specialiserade tekniker) för att flytta laddade molekyler genom en gelmatris. Molekyler migrerar mot elektroden med motsatt laddning:negativt laddade arter reser till anoden, positivt laddade arter till katoden. Eftersom större molekyler upplever mer friktion i gelén, rör de sig långsammare än mindre, vilket möjliggör storleksbaserad separation. Det migrerade avståndet kan plottas på en logaritmisk skala för att uppskatta molekylvikt eller fragmentlängd.
DGGE introducerar en denaturerande gradient - vanligtvis en blandning av urea och formamid - i gelén. När DNA-fragment korsar gradienten destabiliserar ökande denatureringskoncentrationer gradvis dubbelspiralen. Varje fragment slutar migrera när den lokala denatureringskoncentrationen når sin smältpunkt. Denna teknik utnyttjar sekvensberoende smältbeteende för att lösa upp DNA-fragment av identisk längd men olika sekvens.
Vid laddningsbaserad elektrofores leder buffertens joniska arter det applicerade elektriska fältet genom gelén, vilket säkerställer enhetlig strömfördelning. Samtidigt bibehåller buffertens svaga syra-baspar pH inom ett smalt fönster. Eftersom laddningstillståndet och den tredimensionella strukturen hos proteiner och nukleinsyror är pH-beroende, förhindrar ett stabilt pH oavsiktliga konformationsförändringar som kan äventyra separationstroheten.
Att välja rätt buffert beror på det önskade pH-intervallet och behovet av att minimera jonstyrkan, vilket annars skulle kunna generera överdriven värme och distorsion. Vanligt använda buffertar inkluderar:
För optimal prestanda bör buffertens pKa vara nära mål-pH och den totala jonstyrkan bör vara tillräckligt låg för att begränsa ströminducerad uppvärmning samtidigt som effektiv laddningsöverföring tillåts.
Genom att noggrant välja och upprätthålla buffertförhållanden kan forskare uppnå reproducerbara, högupplösta separationer som är nödvändiga för nedströmsanalyser.
