En ny experimentell metod tillåter röntgenanalys av amyloider, en klass av stora, filamentösa biomolekyler som är ett viktigt kännetecken för sjukdomar som Alzheimers och Parkinsons. Ett internationellt team av forskare ledda av DESY-forskare har använt en kraftfull röntgenlaser för att få insikter i strukturen hos olika amyloidprover. Röntgenspridningen från amyloidfibriller ger mönster som liknar dem som Rosalind Franklin fick från DNA 1952, som ledde till upptäckten av den välkända strukturen, den dubbla helixen.
Röntgenlasern, biljoner gånger mer intensiv än Franklins röntgenrör, öppnar upp förmågan att undersöka individuella amyloidfibriller, beståndsdelarna i amyloidfilament. Med sådana kraftfulla röntgenstrålar kan vilket främmande material som helst överväldiga signalen från det osynligt lilla fibrilprovet. Ultratunn kolfilm - grafen - löste detta problem för att tillåta extremt känsliga mönster att registreras. Detta markerar ett viktigt steg mot att studera enskilda molekyler med röntgenlaser, ett mål som strukturbiologer länge har strävat efter. Forskarna presenterar sin nya teknik i tidskriften Naturkommunikation .
Amyloider är långa, ordnade strängar av proteiner som består av tusentals identiska subenheter. Medan amyloider tros spela en viktig roll i utvecklingen av neurodegenerativa sjukdomar, på senare tid har fler och fler funktionella amyloidformer identifierats. "Må-bra-hormonet" endorfin, till exempel, kan bilda amyloidfibriller i hypofysen. De löses upp i enskilda molekyler när surheten i omgivningen förändras, varefter dessa molekyler kan uppfylla sitt syfte i kroppen, " förklarar DESYs Carolin Seuring, en vetenskapsman vid Center for Free-Electron Laser Science (CFEL) och huvudförfattaren till artikeln. "Andra amyloidproteiner, såsom de som finns i obduktionshjärnor hos patienter som lider av Alzheimers, ackumuleras som amyloidfibriller i hjärnan, och kan inte brytas ner och försämrar därför hjärnans funktion på lång sikt."
Forskare försöker bestämma den rumsliga strukturen för amyloider så exakt som möjligt, för att använda denna information för att ta reda på mer om hur proteinfibrillerna fungerar:"Vårt mål är att förstå rollen av bildningen och strukturen av amyloidfibriller i kroppen och i utvecklingen av neurodegenerativa sjukdomar, " säger Seuring när han beskriver lagets motivation. "Den strukturella analysen av amyloider är komplex, och att undersöka dem med befintliga metoder hämmas av skillnader mellan fibrillerna i ett enda prov." Teamet använde röntgenfri elektronlaser LCLS vid SLAC National Accelerator Center i USA.
Ett problem är att strängarna av amyloider, kända som fibriller, kan inte odlas som kristaller, vilket är den vanliga metoden för att utföra atomära upplösningsstrukturstudier med hjälp av röntgenstrålar. Enskilda amyloidfibriller är bara några nanometer tjocka och därför i allmänhet för små för att producera en mätbar signal när de utsätts för röntgenstrålar. Av denna anledning, det vanliga tillvägagångssättet är att rada upp miljontals av dessa fibriller parallellt med varandra, och bunta ihop dem så att deras signaler går ihop. Dock, detta betyder att diffraktionsmönstren produceras av hela ensemblen, och information om strukturella skillnader mellan de enskilda fibrillerna går förlorad. "En stor del av vår förståelse om amyloidfibriller härrör från kärnmagnetisk resonans (NMR) och kryo-elektronmikroskopidata, " förklarar Seuring. "När du arbetar med prover som är lika heterogena som amyloider, fastän, och även när man observerar dynamiken i fibrillbildning, de befintliga metoderna når sina gränser."
För att få tillgång till strukturinformation för sådana heterogena prover i framtiden, teamet valde en ny experimentell metod. Istället för att suspendera de enskilda amyloiderna i en bärarvätska placerade forskarna den på en ultratunn fast bärare gjord av grafen, där kolatomer är ordnade i ett hexagonalt mönster snarare som en atomär bikaka. "Det här provstödet har en dubbel fördel, " säger professor Henry Chapman vid CFEL, som är ledande forskare vid DESY. "För en sak, grafen är bara ett enda lager av atomer tunt och i motsats till en bärarvätska lämnar den ett spår i diffraktionsmönstret. För en annan sak, dess regelbundna struktur ser till att alla proteinfibrillerna är i linje i samma riktning - åtminstone i större domäner." Diffraktionsmönstren för flera fibriller överlappar och förstärker varandra, ungefär som i en kristall, men det finns praktiskt taget ingen störande bakgrundsspridning som i fallet med en bärarvätska. Denna metod gör att diffraktionsmönster kan erhållas från färre än 50 amyloidfibriller, så att de strukturella skillnaderna framträder tydligare. "Vi har observerat karakteristiska asymmetrier i våra data som tyder på att vår teknik till och med kan användas för att bestämma strukturen hos enskilda fibriller, säger Seuring.
"CXI-instrumentet på LCLS gav en exceptionellt ljus, nanofokusstråle som gjorde det möjligt för oss att extrahera data från ett så litet antal fibrer, " rapporterar medförfattaren Mengning Liang, en vetenskapsman vid SLAC. "Fibriller är en tredje kategori av prover som kan studeras på detta sätt med röntgenlasrar, förutom enstaka partiklar och kristaller. I vissa avseenden, fibriller passar mellan de andra två:de har vanliga, återkommande variationer i struktur som kristaller, men utan den stela kristallstrukturen."
Forskarna testade sin metod på prover av tobaksmosaikviruset, också först undersökt av Rosalind Franklin, och som bildar filament av en struktur som nu är känd i stor detalj. Testet gav faktiskt strukturella data om viruset med en noggrannhet på 0,27 nanometer (miljondelar av en millimeter) - motsvarande en upplösning nästan på skalan av en enda atom. Undersökningen av distinkt mindre amyloidfibriller gjorda av endorfin samt amyloidfibriller gjorda av hormonet bombesin, som bland annat är involverat i vissa typer av cancer, gav också en del strukturell information, med en noggrannhet på 0,24 nanometer. Även om uppgifterna var otillräckliga för att beräkna hela strukturen, studien visar mycket lovande för strukturell återhämtning när mer data blir tillgänglig, och öppnar en ny väg för strukturanalys av amyloider med röntgenlasrar. "Det är fantastiskt att vi utför mycket liknande experiment som Franklin gjorde, men de når nu nivån av enskilda molekyler, säger Chapman.
