Forskare har utvecklat ett mikroskop specifikt för att avbilda stora grupper av interagerande celler i deras naturliga miljöer. Instrumentet ger forskare ett nytt verktyg för att avbilda neuroner hos levande djur och kan ge en oöverträffad bild av hur stora nätverk av neuroner interagerar under olika beteenden.

I Optica , The Optical Societys tidskrift för effektfull forskning, forskare från Boston University, USA visar att deras nya "multi-z" konfokala mikroskopisystem kan avbilda hjärnan på levande möss med videohastighet och med ett synfält som är större än en millimeter.

Att avbilda stora grupper av celler kräver att man fångar cellulära eller subcellulära detaljer med höga hastigheter över en stor 3D-volym. Detta är utmanande eftersom de flesta avbildningsmetoder kommer med inneboende kompromisser mellan hastighet, synfält och upplösning.

"Vi hittade ett sätt att slå samman de nödvändiga avbildningsfunktionerna i ett mikroskopisystem som är lätt att bygga och använda, sa Amaury Badon, tidningens första författare. "Det ger också resultat i realtid utan behov av komplicerad dataanalys eller bildbehandling."

Skaffa 3D-bildvolymer

Det nya mikroskopet är baserat på konfokalmikroskopi, en teknik som vanligtvis används för cellavbildning. Konfokalmikroskopi producerar bilder med hög upplösning och kontrast genom att använda ett fysiskt nålhål för att blockera ljus som inte är i fokus och släppa igenom ljus i fokus. Dock, att skanna ett prov för att få tillräckligt med 2D-bilder för att rekonstruera en 3D-volym är tidskrävande och producerar stora mängder data.

För att skaffa flera plan samtidigt, forskarna utvecklade ett sätt att återanvända ljuset för att avbilda celler i ett plan för att även avbilda celler djupare i provet. De använde ett tillvägagångssätt som kallas utökad belysning där mikroskopets objektivlins bara är delvis fylld med det upplysande ljuset, låter ljuset nå djupare in i provet. Hela objektivet används sedan för att detektera fluorescens, som ger hög upplösning. Istället för att ha ett nålhål, som traditionella konfokala inställningar, det nya mikroskopet har en serie reflekterande nålhål som vart och ett fångar ljus i fokus från olika djup i provet.

"Vår metod drar nytta av kontrasten från konfokalmikroskopi samtidigt som den kan sträcka sig till volymetrisk avbildning utan att offra hastigheten, ", sa Badon. "Även om utökad belysning och reflekterande nålhål har använts tidigare, detta är första gången de kombinerades i en konfokalmikroskopuppsättning på ett ljuseffektivt sätt."

Forskarna skräddarsydde också mikroskopet för avbildning i större skala än konventionella konfokala mikroskop och designade det för att avbilda med videohastighet. Snabb bildinsamling var viktig eftersom fluorescensindikatorerna som övervakar cellulär funktion vanligtvis fungerar på tidsskalor på några tiotals millisekunder.

Avbildning av neural aktivitet hos levande djur

Forskarna demonstrerade multi-z konfokalmikroskopisystemet genom att använda det för att avbilda hela C. elegans maskar, som är för stora (500 till 800 mikron långa) för att enkelt kunna avbilda allt på en gång med ett traditionellt konfokalmikroskop. De upptäckte och övervakade samtidigt aktiviteten hos 42 neuroner i hela organismen, även när maskarna rörde sig.

De använde sedan sitt mikroskop för att avbilda hippocampusområdet i en mushjärna hos ett vaket djur vars huvud hölls stilla. De kunde avbilda neuronaktivitet inom en volym som mätte 1200 X 1200 X 100 mikron vid videohastighet. Med hjälp av en algoritm, forskarna kunde identifiera 926 neuroner i den avbildade volymen.

De arbetar nu med att förbättra teknikens hastighet och djupgenomträngning samt att göra mikroskopet så mångsidigt och användarvänligt som möjligt.