Fysiker vid LMU har utvecklat en mycket känslig metod för att mäta den mekaniska stabiliteten hos proteinkonformationer, och använde den för att övervaka de tidiga stegen i bildandet av blodproppar.

Eftersom de centrala förmedlarna av cellfunktion i biologiska organismer, proteiner är involverade i utförandet av praktiskt taget alla cellulära processer. De tillhandahåller den inre byggnadsställningen som ger celler deras form, och möjliggör för celler att dynamiskt ändra sin morfologi. De transporterar substrat fram och tillbaka över membran, och de katalyserar de flesta av de kemiska reaktioner som äger rum i celler. Under dessa uppgifter utsätts många proteiner för yttre krafter. Verkligen, vissa "mekanokänsliga" proteiner mäter effektivt styrkan hos de krafter som verkar på dem och aktiveras när den pålagda kraften överskrider ett givet tröskelvärde. Von Willebrand Factor (VWF), som initierar bildandet av blodproppar, är en viktig representant för denna klass.

De mekaniska krafterna som krävs för att aktivera proteiner som VWF är ofta så små att deras storlek inte kunde bestämmas med befintliga metoder. Nu, ett team av vetenskapsmän ledda av LMU-fysikerna Dr. Martin Benoit och professor Jan Lipfert har utvecklat en mycket känsligare procedur. Deras "magnetiska pincett" kan kvantifiera krafter som är 100 gånger mindre än den vanliga alternativa metoden som finns tillgänglig för närvarande. Som Lipfert och kollegor rapporterar i tidskriften PNAS , de har använt tekniken för att observera utvecklingen av VWF-proteinet under påverkan av låga mekaniska krafter.

En kraftfull metod för att studera mekanoreglering är så kallad proteinkraftspektroskopi. Detta innebär att man drar i en enskild proteinmolekyl och observerar hur en applicerad kraft förändrar dess tredimensionella struktur. Tills nu, den valda metoden för att dra har varit ett atomkraftmikroskop, som fungerar bäst i intervallet 100 piconewton (pN). "Dock, många molekylära processer aktiveras av krafter som är mycket svagare än så, " säger Lipfert. "Så för mätningar på nivån av enskilda molekyler, vi behöver mer känslig instrumentering – det är ingen mening med att använda en badrumsvåg för att väga upp ingredienserna i en tårta."

Forskarna utvecklade en metod där proteinerna fästs i ena änden på en glasyta och bär en tagg i andra änden som binder till små magnetiska pärlor och sammansättningen utsätts sedan för ett externt magnetfält. Förlängning av proteinet som induceras av fältet resulterar i den vertikala förskjutningen av varje pärla, som kan upptäckas med mikroskopi. "Den här typen av upplägg kallas magnetisk pincett, " Lipfert förklarar. "Det har den stora fördelen att det tillåter oss att applicera och lösa upp mycket svaga krafter - betydligt mindre än 1 piconewton - på proteinet av intresse. Dessutom, magnetisk pincett möjliggör mycket stabila mätningar över långa tidsperioder - upp till en vecka."

För att testa den nya metoden, LMU-gruppen använde VWF som sitt målprotein. I blodomloppet, VWF cirkulerar som en multimer av dimerer som är gjorda av två identiska subenheter. Under normala blodflödesförhållanden, den har en relativt kompakt klotform. Dock, varje ökning av skjuvkrafterna i blodomloppet på grund av skada på kärlsystemet får vWF att utvecklas. Detta exponerar bindningsställen för receptorer på blodplättar. Bindning av VWF till blodplättar utlöser i sin tur en reaktionskaskad som leder till koagulering, som tätar såret. "Kaskaden induceras av inverkan på molekylen av mekaniska krafter som verkar som är mycket svagare än de som har uppmätts hittills, ", säger Lipfert. Analys av utdragningen av VWF-dimerer med magnetisk pincett visade att den så kallade VWF-skaftet öppnar sig under en applicerad kraft på mindre än 1 pN, när dimerens underenheter dras isär som de två halvorna av en dragkedja. "Vi antar att detta beteendemönster, som vi kunde observera för första gången, representerar det första steget i blodkoagulation, ", säger Lipfert. "Vårt tillvägagångssätt ger en detaljerad bild av krafterna och förändringarna i förlängningen som är involverade i att utveckla proteinet. Vi är övertygade om att framtida tillämpning av metoden kommer att bidra till en bättre förståelse av verkningssättet för VWF och rollen av kliniskt relevanta mutationer.