Tvåfotonlaserscanningmikroskopi avbildning används vanligtvis för att studera neuronal aktivitet vid cellulära och subcellulära upplösningar i däggdjurshjärnor. Sådana studier är ännu begränsade till en enda funktionell region i hjärnan. I en ny rapport, Mengke Yang och kollegor på Brain Research Instrument Innovation Center, Institutet för neurovetenskap, Center for Systems Neuroscience and Optical System Advanced Manufacturing Technology i Kina, Tyskland och Storbritannien utvecklade en ny teknik med namnet multiarea två-foton i realtid in vitro explorer (MATRIEX). Metoden tillät användaren att rikta in sig på flera regioner i den funktionella hjärnan med ett synfält (FOV) som är ungefär 200 µm i diameter för att utföra tvåfoton Ca ²⁺ avbildning med encellsupplösning samtidigt i alla regioner.

Yang et al. genomfört funktionell avbildning i realtid av enkel-neuronaktiviteter i den primära visuella cortexen, primära motoriska cortex och hippocampus CA1 -region under bedövade och vakna tillstånd hos möss. MATRIEX -tekniken kan unikt konfigurera flera mikroskopiska FOV:er med en enda laserskanningsenhet. Som ett resultat, tekniken kan implementeras som en optisk tilläggsmodul inom befintlig konventionell enkelstrålescanning, tvåfoton-mikroskop utan ytterligare modifieringar. MATRIEX kan appliceras för att utforska multiarea neuronal aktivitet in vivo för hjärnövergripande neural kretsfunktion med encellsupplösning.

Tvåfotonlasermikroskopi uppstod på 1990-talet för att bli populärt bland neurovetenskapare som är intresserade av att studera neurala strukturer och funktioner in vivo. En stor fördel med två-foton och tre-foton-avbildning för levande hjärnor inkluderar den optiska upplösningen som uppnås över tätt märkta hjärnvävnader som starkt sprider ljus, under vilken optiskt snittade bildpixlar kan skannas och förvärvas med minimal överhörning. Dock, fördelarna orsakade också betydande nackdelar med metoden genom att förhindra samtidig visning av två objekt inom ett specifikt avstånd. Forskare hade tidigare implementerat många strategier för att förlänga gränserna, men metoderna var svåra att implementera i neurovetenskapliga forskningslaboratorier. Ändå, en allt högre efterfrågan finns inom neurovetenskapen för att undersöka hjärnövergripande neuronala funktioner med encellsupplösning in vivo.

På ett enkelt sätt, forskare kan placera två mikroskop över samma djurhjärna för att avbilda cortex och cerebellum samtidigt. Men sådana ansträngningar kan leda till betydande ökningar av komplexitet och kostnad. De befintliga höga förväntningarna på prestanda och genomförbarhet ställer därför en mycket utmanande teknisk fråga om hur ett enda bildsystem samtidigt kan få levande mikroskopiska bilder från flera hjärnregioner in vivo. För att ta upp frågan, Yang et al. introducerade en ny metod som kombinerade tvåstegs förstoring och multi-axel optisk koppling.

De insåg metoden med ett torrt objektiv med låg förstoring (DO), med flera vatten nedsänkta, miniatyriserade mål (MO) under det torra målet. Forskarna placerade var och en av MOs vid önskad målposition och djup i hjärnvävnaden. Teamet använde det nya sammansatta föremålsaggregatet på samma sätt som det ursprungliga vattendoppade mikroskopobjektet utan ytterligare modifieringar av bildsystemet för skanning och förvärv.

Forskargruppen sammanställde först MATRIEX -sammansatta målet. För detta, de ersatte det konventionella objektet för nedsänkning av mikroskop med en anpassad sammansatt objektivmontering, inuti ett laserscanningsmikroskop med två foton utrustat med en konventionell enkelstrålescanner. Den sammansatta sammansättningen innehöll flera MO (miniatyriserade mål) infogade genom flera kraniotomier under vilka forskarna limmade en 3D-tryckt plastkammare på skalen av musmodellen. Kammaren anpassade grovt till MOs med samma utrymme för att justera sidoposition och djup. Yang et al. manipulerade exakt de enskilda MO:erna för att se objekten under alla MO samtidigt i samma bildplan.

De implementerade MATRIEX -metoden med hjälp av två principer; tvåstegs förstoring och multiaxiskoppling. Till exempel, med hjälp av tvåstegs förstoring med det torra målet (DO) ensam, de observerade 20 µm pärlor som små suddiga prickar medan de observerade skarpa, runda cirklar genom sammansättningen. Under multiaxiskoppling, forskarna kopplade en enda DO med flera MO på samma bildplan. Med en enkel rasterskanning i en enda rektangulär ram, forskargruppen förvärvade en rektangulär bild som innehåller flera cirkulära FOV (Field of Views)-där varje FOV motsvarade en MO med minimal inter-FOV pixel överhörning.

Forskarna krediterade förstoringen av den numeriska bländaren (NA) för att möjliggöra bättre upplösning med den sammansatta enheten. De tillhörande linserna var också flexibla och specialdesignade för massproduktion till låg kostnad för att underlätta experimentell design. Huvuddragen i MATRIEX var dess förmåga att avbilda flera objekt samtidigt med stora djupintervaller. För att markera detta, Yang et al. designade olika MO med olika parametrar, placera dem på ett specifikt djup där motsvarande objektplan konjugerade på samma axel. I praktiken, forskargruppen kompenserade mindre felaktigheter mellan önskat och verkligt objektdjup genom att justera MO individuellt längs var och en av z -axlarna.

Vanligtvis, under DO (torr mål) är den maximala sidostorleken för målzonen begränsad av den maximala storleken på skanningsfältet. Till exempel, med en DO med 2x förstoring och målzon på 12 mm i diameter, forskare kan avbilda en hel vuxen mushjärna. I den här studien, Yang et al. samtidigt avbildat den främre associeringsbarken och cerebellum hos musen. I praktiken, ett 4x luftmål var lämpligt för att uppnå bättre upplösning för att observera fina dendritstrukturer.

Som principbevis, forskargruppen använde MATRIEX för att utföra tvåfoton Ca samtidigt ²⁺ avbildning av fluorescensmärkta neuroner i den primära visuella cortexen (V1-regionen), primära motoriska cortex (M1 -regionen) och hippocampala CA1 -regionen hos möss. I konfigurationen av de tre MOs, forskarna placerade två MO som lämpar sig för V1 och M1 regionen, direkt ovanför cortex och infogade en MO i hippocampus CA1 -regionen efter kirurgisk avlägsnande av en kortikal vävnad. Teamet utformade sedan linserna för objektplanen som motsvarar V1, M1 och CA1 för konjugering på samma bildplan. Med ett tvåfotonmikroskop utrustat med en 12 kHz resonansskanner, forskarna skannade hela bilden för att observera tre FOV:er och deras enskilda celler efter att ha förstorat de tre olika sektionerna för att lösa enstaka neuroner. Sedan noterade de laserkraften som skulle fördelas mellan flera FOV:er.

Medan Yang et al. kunde ha fått dessa resultat med konventionell enkel-FOV-avbildning inom en enda hjärnregion, MATRIEX-tekniken gav dem data utöver dem som erbjuds med enkel-FOV-bildteknik. Tagen tillsammans, dessa resultat möjliggjorde en mycket inhomogen fördelning och transformation av spontana aktivitetsmönster från det bedövade tillståndet till det vakna tillståndet hos möss, som sträcker sig över en hjärnövergripande kretsnivå vid encellsupplösning.

På det här sättet, Menge Yang och medarbetare utvecklade MATRIEX-tekniken baserad på principen om tvåstegs förstoring och multiaxis optisk koppling. De genomförde samtidigt två-foton Ca ²⁺ avbildning i neuronala befolkningsaktiviteter på olika djup i olika regioner (V1, M1 och CA1) i sövda och vakna möss med encellsupplösning. Viktigt, vilket konventionellt tvåfotonmikroskop som helst kan omvandlas till ett MATRIEX-mikroskop, samtidigt som alla ursprungliga funktioner bevaras. Nyckeln till transformation är baserad på utformningen av en sammansatt objektivmontering. Forskarna kan använda olika, noggrant utformade MO:er för att passa olika hjärnregioner med 100 procent kompatibilitet mellan MATRIEX -tekniken och konventionell mikroskopi. Forskargruppen förväntar sig att MATRIEX-tekniken väsentligt går framåt tredimensionellt, hjärnövergripande neuralkretsdynamik vid encellsupplösning.

© 2019 Science X Network