Ljus - och alla vågor - kan böja runt hörnen av hinder som finns längs dess väg. På grund av detta fenomen, kallas diffraktion, det är omöjligt att fokusera ljuset på en plats som är mindre än halva dess våglängd. Med andra ord, den högsta upplösningen man teoretiskt kan uppnå med ett optiskt mikroskop är cirka 250 nm, en barriär som kallas diffraktionsgränsen. Tyvärr, denna upplösning är inte tillräckligt för att observera fina cellulära strukturer, som de som finns i neuroner.

I mer än ett sekel har Mikroskopister hamstades av denna klassiska barriär tills uppfinningen av fluorescensmikroskopi med superupplösning. Ett särskilt kraftfullt tillvägagångssätt utvecklades i slutet av 1990-talet och myntade "stimulerad utsläppsutarmning" (STED) mikroskopi. Denna teknik kräver att målprovet innehåller fluoroforer, som är föreningar som absorberar ljus vid en våglängd och sedan avger det igen vid en längre. I den enklaste versionen av STED -mikroskopi, fluoroforer exciteras på en cirkulär plats genom bestrålning med en diffraktionsbegränsad fokuserad laser. Sedan, en munkformad del runt platsen bestrålas med mindre energiskt ljus-utarmningsstrålen-som stänger av fluorescensen genom stimulerad emission. Således, nettoeffekten är att endast fluoroforerna i mitten av munken sänder ut fotoner. Eftersom det området kan göras godtyckligt litet, detta möjliggör superupplöst mikroskopi.

Även om STED -mikroskopi var ett verkligt genombrott för att observera morfologin hos levande neuroner vid högre upplösning, det finns fortfarande utrymme för förbättringar. I en ny studie publicerad i Neurofotonik , ett team av forskare under ledning av doktor U. Valentin Nägerl från Université de Bordeaux utvecklade en enkel men effektiv kalibreringsmetod som möjliggör mer exakt STED -avbildning vid högre vävnadsdjup. Deras tillvägagångssätt bygger på att analysera och korrigera för en av huvudkällorna till systematiska fel i STED -mikroskopi för biologiska prover:sfärisk aberration av utarmningsstrålen.

Vid avbildning av ett vävnadsprov på högre djup än 40μm, utarmningsstrålen lider av olika typer av inriktning och nedbrytning (aberration) och förlorar sin noggrant utformade form, vilket är viktigt för STED -metoden. Sfärisk aberration är den största gärningsmannen och var den som forskarna riktade sig mot. Deras strategi var att först förbereda ett hjärnvävnads fantomprov, en gelbaserad proxy med ett brytningsindex som liknar den i själva hjärnan. Detta fantomprov innehöll homogent dispergerade fluoroforer och guldnanopartiklar, vilket gjorde att laget tydligt kunde visualisera och kvantifiera hur formen på utarmningsstrålen förvrängdes när den trängde djupare. Sedan, de beräknade de nödvändiga förjusteringarna som skulle göras på utarmningsstrålen enligt vävnadsdjup så att dess slutliga form närmare matchar den ideala. Justeringarna gjordes med adaptiv optik, som är en teknik som ursprungligen utvecklats av astronomer för att förbättra teleskopiska bilder som lider av avvikelser orsakade av jordens atmosfär.

När formen på utarmningsstrålen hade kalibrerats enligt fantomtesterna, forskarna fortsatte att bilda levande neural vävnad. De jämförde resultaten från vanlig STED -mikroskopi, korrigerad STED -mikroskopi, och tvåfotonmikroskopi-en teknik som är speciellt anpassad för djupt vävnadsavbildning. Resultaten var ganska övertygande:korrigerade STED -bilder fångade de fina detaljerna i djupare neurala dendriter mycket bättre än vanliga STED -bilder. "Med hjälp av vår kalibreringsstrategi, vi kunde mäta neuronala strukturer så små som 80 nm på ett djup av 90 μm inuti biologisk vävnad och erhålla en signalökning på 60 procent efter korrigering för sfärisk aberration, säger Nägerl.

Ji Yi, professor i biomedicinsk teknik vid Johns Hopkins University konstaterar att "mikroskopi med superupplösning främst har applicerats på tunna exemplar, såsom enkellagerceller, där ljusspridning är försumbar. Teamet under ledning av Valentin Nägerl implementerade adaptiv optik i en tvåfotonstimulerad utsläppsminskningsmikroskopi (2P-STED), och uppnådde 80nm upplösning av avbildande neuron dendritiska ryggrader genom 90 mikron hjärnvävnad. Detta är anmärkningsvärt eftersom superupplösning är svår att bibehålla i tjockare vävnad-särskilt med tanke på den mycket spridande kvaliteten på hjärnvävnad. "Yi förklarar att framsteget kommer att underlätta studier av neurala aktiviteter och interaktioner.

Med tanke på att denna nya kalibreringsprocess är robust, enkelt att genomföra, och relativt billigt, det kan enkelt införlivas i standardiserade laboratoriepraktiker för att få bättre resultat med STED -mikroskop, så länge det beredda fantomprovet matchar det biologiska provets optiska egenskaper. I detta avseende, Nägerl säger, "vårt tillvägagångssätt är inte begränsat till hjärnprover; det kan anpassas till andra vävnader med kända och relativt homogena brytningsindex, liksom andra typer av preparat, även potentiellt i det intakta, levande mushjärna. "