En banbrytande teknik utvecklad av Prevedel Group vid EMBL tillåter neuroforskare att observera levande neuroner djupt inne i hjärnan – eller vilken annan cell som helst gömd i en ogenomskinlig vävnad. Tekniken är baserad på två toppmoderna mikroskopimetoder, trefotonmikroskopi och adaptiv optik. Tidningen som rapporterar om detta framsteg publicerades den 30 september 2021 i Naturmetoder .

Fram till utvecklingen av den nya tekniken, det var utmanande för neuroforskare att observera astrocyter som genererade kalciumvågor i djupa lager av cortex, eller för att visualisera andra neurala celler i hippocampus, en region djupt i hjärnan som är ansvarig för rumsminne och navigering. Fenomenet sker regelbundet i hjärnan hos alla levande däggdjur. Genom att utveckla den nya tekniken, Lina Streich från Prevedel Group och hennes medarbetare kunde fånga de fina detaljerna i dessa mångsidiga celler med oöverträffad hög upplösning. Det internationella laget inkluderade forskare från Tyskland, Österrike, Argentina, Kina, Frankrike, USA, Indien, och Jordan.

Inom neurovetenskap, hjärnvävnader observeras mestadels i små modellorganismer eller in ex vivo-prover som måste skäras upp för att kunna observeras – båda representerar icke-fysiologiska tillstånd. Normal hjärncellsaktivitet sker endast hos levande djur, men "mushjärnan är en mycket spridande vävnad, " sade Robert Prevedel. "I dessa hjärnor, ljus kan inte fokuseras särskilt lätt, eftersom det interagerar med de cellulära komponenterna. Detta begränsar hur djupt du kan skapa en skarp bild, och det gör det väldigt svårt att fokusera på små strukturer djupt inne i hjärnan med traditionella tekniker."

Tack vare Streich, en före detta doktorand i labbet som arbetat i mer än fyra år för att övervinna detta problem, forskare kan nu titta längre in i vävnader.

"Med traditionella tekniker för fluorescens-hjärnmikroskopi, två fotoner absorberas av fluorescensmolekylen varje gång, och du kan se till att spänningen som orsakas av strålningen är begränsad till en liten volym, " förklarade Prevedel, en fysiker av utbildning. "Men ju längre fotonerna färdas, desto mer sannolikt går de förlorade på grund av spridning." Ett sätt att övervinna detta är att öka våglängden på de spännande fotonerna mot det infraröda, vilket säkerställer tillräckligt med strålningsenergi för att absorberas av fluoroforen. Dessutom, att använda tre fotoner istället för två gör det möjligt att få skarpare bilder djupt inne i hjärnan. Men en annan utmaning kvarstår:se till att fotonerna är fokuserade, så att hela bilden inte blir suddig.

Det är här den andra tekniken som används av Streich och hennes team är viktig. Adaptiv optik används regelbundet inom astronomi – och det var verkligen avgörande för Roger Penrose, Reinhard Genzel och Andrea Ghez får Nobelpriset i fysik 2020 för deras upptäckt av svarta hål. Astrofysiker använder deformerbara, datorstyrda speglar för att i realtid korrigera den distorsion i ljusvågsfronten som orsakas av atmosfärisk turbulens. I Prevedels labb, distorsionen orsakas av den spridande inhomogena vävnaden, men principen och tekniken är väldigt lika. "Vi använder också en aktivt kontrollerad deformerbar spegel, som kan optimera vågfronterna för att låta ljuset konvergera och fokusera även djupt inne i hjärnan, " förklarade Prevedel. "Vi utvecklade ett anpassat tillvägagångssätt för att göra det snabbt nog att använda på levande celler i hjärnan, " tillade Streich. För att minska teknikens invasivitet, teamet minimerade också antalet mätningar som behövdes för att uppnå bilder av hög kvalitet.

"Det här är första gången dessa tekniker har kombinerats, sade Streich, "och tack vare dem, vi kunde visa de djupaste in vivo-bilderna av levande neuroner i hög upplösning." Forskarna, som arbetade i samarbete med kollegor från EMBL Rom och universitetet i Heidelberg, till och med visualiserade dendriterna och axonerna som förbinder neuronerna i hippocampus, samtidigt som hjärnan lämnas helt intakt.

"Detta är ett steg mot att utveckla mer avancerade icke-invasiva tekniker för att studera levande vävnader, ", sa Streich. Även om tekniken utvecklades för användning på en mushjärna, det är lätt att applicera på all ogenomskinlig vävnad. "Förutom den uppenbara fördelen med att kunna studera biologiska vävnader utan att behöva offra djuren eller ta bort överliggande vävnad, denna nya teknik öppnar vägen för att studera ett djur longitudinellt, det är, från början av en sjukdom till slutet. Detta kommer att ge forskare ett kraftfullt instrument för att bättre förstå hur sjukdomar utvecklas i vävnader och organ."