Biologiska cellavbildningsresultat. a–c Avbildningsresultaten för confocal, STED respektive dmdSTED. Skalstång:2 μm. d–f Delvis förstorad vy av delar som indikeras av den blå streckade rutan i a–c. Skalstång:1 μm. g Variationskurva för bildintensitet längs den blå prickade linjen. De blå, röda och gula linjerna motsvarar konfokal, STED respektive dmdSTED. Provet som används här är vimentin märkt med Star Green. Kredit:Wang, Li, et al., doi 10.1117/1.AP.4.4.046001
Nanoskopi beskriver förmågan att se bortom den allmänt accepterade optiska gränsen på 200–300 nm. Stimulerad emissionsutarmning (STED) mikroskopi, utvecklad av Stefan W. Hell och Jan Wichmann 1994, och experimentellt demonstrerad av Hell och Thomas Klar 1999, är en superupplösningsteknik för nanoskopi. STED-mikroskopi har gjort avsevärda framsteg och används flitigt i praktisk forskning. Men dess praktiska användning innebär en del oönskat bakgrundsbrus, vilket negativt påverkar rumslig upplösning och bildkvalitet. I allmänhet kommer detta brus från två signalkällor:(i) fluorescens genererad av återexcitering orsakad av ultrahöga ljusdoser från utarmningsstrålen; och (ii) kvarvarande fluorescens, på grund av otillräcklig utarmning av inhiberingsstrålen.
Betydande metoder för borttagning av bakgrund har utvecklats under de senaste decennierna. Dessa kan delas in i tre kategorier:tidsdomän, rymddomän och fasdomän. Vissa av dessa metoder är långvariga och några är mer nyligen utvecklade. Även om kraftfulla sätt att ta bort oönskat brus från STED-mikroskopbilder, medför de alla nackdelar, inklusive bildförvrängning, förlängda insamlingstider eller introduktion av skottbrus. STED-mikroskopi har ännu inte uppnått sin fulla potential.
Som rapporterats i Avancerad fotonik , utvecklade forskare från Zhejiang University nyligen en ny metod som kallas "dual-modulation difference" STED (dmdSTED) för att undertrycka bakgrunder selektivt och effektivt. Metoden fungerar genom att sortera rymddomänsignaler i frekvensdomänen så att den icke-utarmade fluorescensen och STED-inducerade bakgrunden bekvämt separeras från de önskade fluorescerande signalerna. Excitations- och utarmningsstrålarna laddas med olika tidsdomänmodulationer. Eftersom den undviker den återexcitering som orsakas av utarmningsstrålen, kan en utarmningslaser med en våglängd närmare toppen av provets fluorescensemissionsspektrum väljas, vilket minskar den erforderliga utarmningsintensiteten.
Den nuvarande versionen av dmdSTED presterar med rumslig upplösning på λ/8, högre upplösning än den för fasdomänmetoderna (t.ex. SPLIT, λ/5) som är benägna att skjuta brus. Teoretiskt sett kan potentiell signalförlust genom tidsdomäntillvägagångssätt (som time-gating) undvikas med detta tillvägagångssätt. Dessutom är dmdSTED kompatibel med antingen pulsade eller kontinuerliga vågscenarier, och hårdvara för tidskorrelerad enkelfotonräkning (TCSPC) krävs inte. Jämfört med rymddomänmetoder är tidsupplösningen för dmdSTED inte begränsad. Således är dmdSTED fördelaktigt vid förvärv av heltäckande fina mikroskopiska bilder, i rumslig upplösning, SNR och tidsupplösning.
Enligt seniorförfattaren Xu Liu, chef för State Key Laboratory of Modern Optical Instrumentation, "Denna frekvensdomänmetod har stor potential att integreras i andra dual-beam punktskanningstekniker, som excited state saturation microscopy (ESSat), laddningstillstånd utarmningsmikroskopi (CSD), grundtillståndsutarmningsmikroskopi (GSD) och så vidare. Dessutom kan den acceptera fler typer av prover med spektrala egenskaper som skiljer sig från vanliga fluorescerande färgämnen i STED, såsom vissa kvantprickar med ett bredare excitationsspektrum. " + Utforska vidare
