Bruce Cohen (rt) i labbet med praktikanten Katherine Chuang.
(Phys.org) -- Föreställ dig att spåra ett rådjur genom en skog genom att fästa en radiosändare på örat och övervaka rådjurens plats på distans. Föreställ dig nu att sändaren är lika stor som ett hus, och du förstår problemet som forskare kan stöta på när de försöker använda nanopartiklar för att spåra proteiner i levande celler.
Att förstå hur ett protein rör sig runt en cell hjälper forskarna att förstå proteinets funktion och de cellulära mekanismerna för att tillverka och bearbeta proteiner. Denna information hjälper också forskare att studera sjukdomar, vilket på cellnivå kan innebära att ett protein inte fungerar, slutar göras, eller skickas till fel del av cellen. Men nanopartikelsonder som är för stora kan störa ett proteins normala aktiviteter.
Nu är ett team av forskare ledda av Bruce Cohen från Lawrence Berkeley National Laboratory's Molecular Foundry, ett U.S. Department of Energy (DOE) nanovetenskapscenter, har kommit på hur man odlar ljusemitterande nanokristaller små nog att inte störa cellaktivitet men tillräckligt ljusa för att avbildas en i taget. Cohen är motsvarande författare till en artikel den 16 februari, 2012 års nummer av ACS Nano som beskriver detta verk med titeln, "Kontrollerad syntes och enpartikelavbildning av ljus, Sub-10 nm lantaniddopade uppkonverterande nanokristaller.” Medförfattare är Alexis Ostrowski, Emory Chan, Daniel Gargas, Elan Katz, Gang Han, James Schuck, och Delia Milliron.
"Forskare har i åratal försökt studera proteinbeteende genom att märka dem med ljusavgivande sonder, sa Cohen. "Men problemet är att hitta rätt sorts sond. Vårt tillvägagångssätt är att göra uppkonverterande nanopartikelsonder tillräckligt små för att de inte ska störa proteinbeteende."
Gör en bättre sond
Förr, forskare använde fluorescerande molekyler eller kvantprickar som sonder. Med hjälp av toppmodern optik och mikroskop, forskare kan lösa ljus som kommer från enstaka molekyler fästa vid proteiner, som talar om för dem var proteinet finns i en cell. Sondmolekylerna i dessa experiment tenderar att brytas ned eller "fotobleka" snabbt, begränsa forskarna till bara några sekunders kontinuerlig avbildning eller en serie bilder tagna med sekunders mellanrum. De alternativa sonderna, kvantprickar, lider mindre av fotoblekning men istället flimrar de av och på, på liknande sätt begränsar deras användbarhet som sonder.
Gjuteriteamet ville undvika både blinkning och blekning, så de övergick till nanokristaller av natriumyttriumfluorid (NaYF 4 ) med spårmängder av lantanidelement ytterbium och erbium, som, de upptäckte, avge ljus, stadigt ljus idealiskt för bioavbildning. Mer viktigt, dessa nanokristaller "uppkonverterar" ljus, absorberar lågenergifotoner och återutsänder dem vid högre energier.
"Vanligtvis när något fluorescerande absorberar ljus avger det ljus med en något lägre energi. Uppkonvertering går åt andra hållet, faktiskt öka energin hos ljuset som sänds ut, sa Cohen. "I vårt fall är vi spännande med ljus med ganska låg energi, nära infrarött (bortom rött i det synliga spektrumet), och sedan avger nanokristallerna ljus i det synliga området, som grönt eller rött, som faktiskt har högre energi."
Fördelen med att uppkonvertera nanokristaller är att cellerna inte uppkonverterar ljus själva. Normalt när forskare avbildar en cell med hjälp av molekylära sonder, de använder ljus med synlig våglängd för att både excitera och avbilda. Tyvärr, massor av saker i cellen återsänder också absorberat ljus vid dessa våglängder, vilket skapar bakgrundsljud i bilden och tvingar forskarna att använda fler sonder och ljusare ljuskällor. Med uppkonverterande nanokristaller, forskare kan försiktigt stimulera med infrarött ljus och titta på synligt ljus från enstaka sonder som står tydligt mot en mörk bakgrund.
"Den andra fördelen med att uppkonvertera nanokristaller är att nära-infrarött ljus är mycket mindre skadligt för celler än, säga, synligt eller ultraviolett ljus, sa Cohen. "Det betyder när vi gör dessa mycket långa avbildningsexperiment med intensiva krafter av ljus för att se enstaka molekyler, vi använder våglängder som är ganska godartade för celler."
En kombinatorisk lösning
Nanokristaller av NaYF 4 kan bildas i två olika geometrier som kallas alfa och beta. Beta-fas nanokristallerna är mer effektiva vid uppkonvertering och därmed bättre för bioavbildning, men de är också svårare att odla. För att spika fast tillväxtparametrarna för att få reproducerbar beta-NaYF 4 nanokristaller, teamet använde Molecular Foundrys WANDA-robot – Workstation for Automated Nanomaterial Discovery and Analysis – utvecklad av Berkeley Labs Emory Chan och Delia Milliron.
"Inget av detta skulle vara möjligt utan att kunna göra det vi på Foundry kallar kombinatorisk nanovetenskap. I grund och botten innebär det att köra massor av olika reaktioner i WANDA för att lära sig hur man kontrollerar storleken eller färgen på nanopartiklarna, sa Cohen. "Vi har kört tusentals olika reaktioner för att lära oss hur man odlar dessa saker."
Mindre nanopartiklar betyder mindre ljus, så laget var tvungen att hitta den söta platsen:
Hur små skulle de kunna göra dem och fortfarande kunna avbilda enskilda nanokristaller i ett levande system? "Det som är en av de fina sakerna med att ha den här kontrollen är att vi inte bara kan göra dem nere till, säga, 5 nanometer, men vi vet också förutsättningarna för att göra dem större om vi behöver göra dem ljusare, sa Cohen.
För att hjälpa till att förstå geometrin hos deras nanokristaller, medförfattaren James Schuck bad en sommarpraktikant att göra en datormodell av kristallstrukturen. Andrew Mueller, en gymnasieelev från Vistamar School i Los Angeles, gick dock långt utöver en enkel kristallstruktur.
"Jag började med att bara sätta ihop former baserat på vad som fanns i litteraturen för kristallen, sa Mueller. "Sedan ville jag visa hur det såg ut i en nanokristall så jag flyttade runt kameran i strukturen och panorerade ut för att visa hur atomer möts i en nanokristall." Mueller lade senare till animering av två fotoner som absorberas och uppkonverteras till en enda emitterad foton.
"Videon är ett bra svar på frågan, vad är en nanokristall?” sa Cohen. "Du kan se att detta egentligen bara är några hundra eller kanske ett par tusen atomer i en nanokristall, ordnade i små, vanliga mönster.”
Nästa, teamet vill sätta de uppkonverterande nanokristallerna i verket och faktiskt kartlägga enskilda proteiner som rör sig genom en cell. "En av de saker vi skulle vilja studera är hur två neuroner möts, hur två hjärnceller går samman för att bilda en synaps - utrymmena mellan neuroner som ansvarar för all hjärnaktivitet, sa Cohen. "Det är känt att det finns vissa par av proteiner som kommer samman från två neuroner och de hittar varandra och bildar en synaps, men frågan är, hur många av dem behöver du? Hur många par proteiner? Är bara en interaktion tillräckligt för att få en synaps att bildas, vänder de sig, och så vidare? Nu när vi vet hur man gör exakt de nanopartiklar vi vill ha, nästa steg är att testa dem i en cell.”
Detta arbete stöddes av U.S. Department of Energy Office of Science.
