Nanoporer kan en dag leda till en revolution inom DNA-sekvensering. Genom att föra DNA-molekyler en i taget genom små hål i ett tunt membran, det kan vara möjligt att avkoda långa DNA-sträckor med blixtens hastighet. Forskare, dock, har inte riktigt räknat ut fysiken för hur polymersträngar som DNA interagerar med nanoporer. Nu, med hjälp av en viss typ av virus, forskare från Brown University har kastat nytt ljus över denna fysik i nanoskala.

"Det som fick oss att intressera oss för detta var att alla inom området studerade DNA och utvecklade modeller för hur de interagerar med nanoporer, sa Derek Stein, docent i fysik och teknik vid Brown som ledde forskningen. "Men även de mest grundläggande sakerna du hoppas modeller skulle förutsäga med utgångspunkt från de grundläggande egenskaperna hos DNA - du kunde inte göra det. Det enda sättet att bryta sig ur det hjulspåret var att studera något annat."

Resultaten, publiceras idag i Naturkommunikation , kan inte bara hjälpa till med utvecklingen av nanopore-enheter för DNA-sekvensering, de kan också leda till ett nytt sätt att upptäcka farliga patogener.

Att räta ut fysiken

Konceptet bakom nanopore-sekvensering är ganska enkelt. Ett bara några miljarddels meter brett hål sticks i ett membran som skiljer två pölar med saltvatten åt. En elektrisk ström tillförs systemet, som då och då fångar en laddad DNA-sträng och piskar den genom poren – ett fenomen som kallas translokation. När en molekyl translokerar, det orsakar detekterbara variationer i den elektriska strömmen över poren. Genom att noggrant titta på dessa variationer i ström, forskare kanske kan särskilja enskilda nukleotider - A:en, C:s, G och T kodade i DNA-molekyler.

De första kommersiellt tillgängliga nanopore-sequencers kanske bara är några år bort, men trots framsteg på området, förvånansvärt lite är känt om den grundläggande fysiken som är involverad när polymerer interagerar med nanoporer. Det beror delvis på komplexiteten i att studera DNA. I lösning, DNA-molekyler bildar bollar av slumpmässiga krumlor, vilket gör det extremt svårt att förstå deras fysiska beteende.

Till exempel, faktorerna som styr hastigheten för DNA-translokation är inte väl förstått. Ibland glider molekyler snabbt genom en por; andra gånger glider de långsammare, och ingen förstår helt varför.

En möjlig förklaring är att den snirkliga konfigurationen av DNA gör att varje molekyl upplever skillnader i motstånd när de dras genom vattnet mot poren. "Om en molekyl skrynklas ihop bredvid poren, den har kortare sträcka att resa och upplever mindre motstånd, " sa Angus McMullen, en doktorand i fysik vid Brown och studiens huvudförfattare. "Men om den sträcks ut så skulle den kännas drag längs hela längden och det skulle göra att den går långsammare."

Drageffekten är omöjlig att isolera experimentellt med hjälp av DNA, men viruset McMullen och hans kollegor studerade erbjöd en lösning.

Forskarna tittade på fd, ett ofarligt virus som infekterar t.ex. coli bakterier. Två saker gör viruset till en idealisk kandidat för studier med nanporer. Först, fd-virus är alla identiska kloner av varandra. Andra, till skillnad från snirkligt DNA, fd-virus är en stel, stavliknande molekyl. Eftersom viruset inte kryper ihop sig som DNA gör, effekten av drag på var och en bör vara i stort sett densamma varje gång.

Med drag eliminerad som en källa till variation i translokationshastighet, forskarna förväntade sig att den enda källan till variation skulle vara effekten av termisk rörelse. De små virusmolekylerna stöter ständigt upp mot vattenmolekylerna som de är nedsänkta i. Några slumpmässiga termiska sparkar bakifrån skulle påskynda viruset när det går genom porerna. Några sparkar framifrån skulle sakta ner.

Experimenten visade att även om termisk rörelse förklarade mycket av variationen i translokationshastighet, det förklarade inte allt. Till forskarnas stora förvåning, de hittade en annan variationskälla som ökade när spänningen över poren ökades.

"Vi trodde att fysiken skulle vara kristallklar, sa Jay Tang, docent i fysik och teknik vid Brown och en av studiens medförfattare. "Du har det här stela [viruset] med väldefinierad diameter och storlek och du kan förvänta dig en mycket tydlig signal. Som det visar sig, vi hittade lite förbryllande fysik som vi bara delvis kan förklara oss själva."

Forskarna kan inte med säkerhet säga vad som orsakar variationen de observerade, men de har några idéer.

"Det har förutspåtts att beroende på var [ett föremål] är inuti poren, det kan dras hårdare eller svagare, " sa McMullen. "Om det är i mitten av poren, den drar lite svagare än om den är precis på kanten. Det har förutspåtts, men aldrig experimentellt verifierad. Detta kan vara bevis på att det händer, men vi gör fortfarande uppföljningsarbete."

Mot en nanopore-sequencer och mer

En bättre förståelse av translokationshastighet kan förbättra noggrannheten av nanopore-sekvensering, säger McMullen. Det skulle också vara till hjälp i den avgörande uppgiften att mäta längden på DNA-strängar. "Om du kan förutsäga translokationshastigheten, "McMullen sa, "då kan du enkelt få DNA -längden från hur lång dess translokation var."

Forskningen hjälpte också till att avslöja andra aspekter av translokationsprocessen som kan vara användbara för att designa framtida enheter. Studien visade att den elektriska strömmen tenderar att anpassa virushuvudet först till poren, men vid tillfällen när de inte står i rad, de tenderar att studsa runt på kanten av poren tills termiska rörelser anpassar dem för att gå igenom. Dock, när spänningen var för hög, de termiska effekterna undertrycktes och viruset fastnade på membranet. Det tyder på en sweet spot i spänningen där huvudförst translokation är mest sannolikt.

Inget av detta kan observeras direkt – systemet är helt enkelt för litet för att ses i aktion. Men forskarna kunde sluta sig till vad som hände genom att titta på små förändringar i strömmen över poren.

"När virusen missar, de rasslar runt och vi ser dessa små gupp i strömmen, " sa Stein. "Så med dessa små gupp, vi börjar få en uppfattning om vad molekylen gör innan den glider igenom. Normalt är dessa sensorer blinda för allt som pågår tills molekylen glider igenom."

Det hade varit omöjligt att observera med hjälp av DNA. DNA-molekylens floppighet gör att den kan gå genom en por i en vikt konfiguration även om den inte är riktad rakt mot varandra. Men eftersom viruset är stel, den kan inte vikas för att gå igenom. Det gjorde det möjligt för forskarna att isolera och observera den kontaktdynamiken.

"Dessa virus är unika, " sa Stein. "De är som perfekta små måttstockar."

Förutom att belysa grundläggande fysik, verket kan också ha en annan tillämpning. Även om FD-viruset i sig är ofarligt, bakterierna den infekterar – t.ex. coli — är det inte. Baserat på detta arbete, det kan vara möjligt att bygga en nanopore-enhet för att detektera närvaron av fd, och genom ombud, e. coli. Andra farliga virus - Ebola och Marburg bland dem - delar samma stavliknande struktur som fd.

"Det här kan vara ett enkelt sätt att upptäcka dessa virus, " Sa Tang. "Så det är en annan potentiell tillämpning för detta."