Att använda fysikalisk kemi metoder för att titta på biologi på nanoskala, en forskare från Lawrence Berkeley National Laboratory (Berkeley Lab) har uppfunnit en ny teknik för att avbilda enstaka molekyler med oöverträffad spektral och rumslig upplösning, vilket leder till det första "sanna färg" mikroskopet med superupplösning.

Ke Xu, en fakultetsforskare vid Berkeley Labs Life Sciences Division, har döpt sin innovation till SR-STORM, eller spektralt upplöst stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi. Eftersom SR-STORM ger full spektral och rumslig information för varje molekyl, Tekniken öppnar dörren till högupplöst bildbehandling av flera komponenter och lokala kemiska miljöer, såsom pH-variationer, inne i en cell.

Forskningen rapporterades i tidskriften Naturmetoder i en tidning med titeln, "Ultrahigh-throughput enkelmolekylspektroskopi och spektralt upplöst superupplösningsmikroskopi, " med medförfattarna Zhengyang Zhang, Samuel Kenny, Margaret Hauser, och Wan Li, hela UC Berkeley. Xu är också biträdande professor vid UC Berkeleys avdelning för kemi.

"Vi mäter både position och spektrum för varje enskild molekyl, plotta dess superupplösta rumsliga position i två dimensioner och färga varje molekyl enligt dess spektrala position, så i den meningen, det är äkta färgs superupplösningsmikroskopi, som är den första i sitt slag, " sa Xu. "Detta är en ny typ av bildbehandling, kombinerar en molekyl spektral mätning med superupplösningsmikroskopi."

Vad mer, SR-STORM har hög genomströmning, kan leverera rumslig och spektral information för miljontals enskilda molekyler på cirka fem minuter, jämfört med flera minuter för en enda bildruta som omfattar tiotals molekyler med hjälp av konventionella skanningsbaserade tekniker.

Xu byggde på arbete han gjorde som postdoktor vid Harvard med Xiaowei Zhuang, vem uppfann STORM, en superupplösningsmikroskopimetod baserad på enmolekylavbildning och fotoväxling. Genom att utforma ett dubbelobjektivsystem med två mikroskoplinser vända mot varandra, Xu och kollegor tittade på framsidan och baksidan av provet samtidigt och uppnådde en oöverträffad optisk upplösning (på cirka 10 nanometer) av en cell. Genom att använda denna metod för att avbilda neuroner, de visade att aktin, en nyckelkomponent i cytoskelettet (cellens ryggrad), har en annan struktur i axoner än i dendriter, två delar av en neuron.

Men nuvarande superupplösningsmikroskopitekniker levererar inte spektral information, vilket är användbart för forskare att förstå beteendet hos enskilda molekyler, samt att möjliggöra flerfärgsbilder av hög kvalitet av flera mål.

"Så vi konstruerade ett system med dubbla mål men spred den enmolekylära bilden som samlats in av en objektivlins i spektrum samtidigt som vi behöll den andra bilden för lokalisering av en molekyl, " sa Xu. "Nu ackumulerar vi samtidigt spektrumet av de enskilda molekylerna och även deras position, så vi löste gåtan."

Därefter färgade de provet med 14 olika färgämnen i ett smalt emissionsfönster och exciterade och fotoväxlade molekylerna med en laser. Medan spektra av de 14 färgämnena är kraftigt överlappande eftersom de är nära i emission, de fann att spektra för de individuella molekylerna var förvånansvärt olika och därmed lätt identifierbara. "Det är användbart eftersom det betyder att vi hade ett sätt att göra flerfärgsbilder inom ett mycket smalt emissionsfönster, " sa Xu.

Verkligen, använda fyra färgämnen för att märka fyra olika subcellulära strukturer, såsom mitokondrier och mikrotubuli, de kunde enkelt särskilja molekyler av olika färgämnen baserat enbart på deras spektrala medelvärde, och varje subcellulär struktur hade en distinkt färg.

"Så med den här metoden kan vi titta på interaktioner mellan fyra biologiska komponenter inuti en cell i tredimensionell och med mycket hög upplösning på cirka 10 nanometer, " Xu sa. "Ansökningarna är mestadels inom grundforskning och cellbiologi vid denna tidpunkt, men förhoppningsvis kommer det att leda till medicinska tillämpningar. Detta ger oss nya möjligheter att titta på cellstrukturer, hur de är uppbyggda, och om det finns någon nedbrytning av dessa strukturer i sjukdomar."

Många sjukdomar orsakas antingen av en invaderande patogen eller nedbrytning av en cells inre struktur. Alzheimers, till exempel, kan vara relaterat till nedbrytning av cytoskelettet inuti neuroner. "Cytoskelettsystemet består av en mängd interagerande subcellulära strukturer och proteiner, och vår teknik kommer att möjliggöra forskning om interaktioner mellan dessa olika mål med ett aldrig tidigare skådat antal färgkanaler och rumslig upplösning, " han sa.

Nästa, Xu försöker förfina metoden genom att använda ett system med ett mål, och få det att fungera med konventionella mikroskopsystem, vilket gör det mer allmänt tillgängligt. Han försöker också utveckla lämpliga färgämnen och sonder för att övervaka den lokala miljön, såsom pH, i levande celler på nanometerskala.