Som en del av ett internationellt forskarlag, Jeff Donatelli, Peter Zwart och Kanupriya Pande från Center for Advanced Mathematics for Energy Research Applications (CAMERA) vid Lawrence Berkeley National Laboratory (Berkeley Lab) bidrog med nyckelalgoritmer som hjälpte till att uppnå ett mål som först föreslogs för mer än 40 år sedan - med hjälp av vinkelkorrelationer av röntgenstrålning ögonblicksbilder från icke-kristallina molekyler för att bestämma 3D-strukturen för viktiga biologiska objekt. Denna teknik har potential att tillåta forskare att belysa biologisk struktur och dynamik som tidigare var omöjliga att observera med traditionella röntgenmetoder.

Genombrottet resulterade från ett enpartikeldiffraktionsexperiment utfört vid Department of Energys (DOE:s) Linac Coherent Light Source (LCLS) av Single-Particle Initiative organiserat av SLAC National Accelerator Laboratory. Som en del av detta initiativ, CAMERA-teamet kombinerade ansträngningar med Ruslan Kurta, en fysiker vid den europeiska XFEL-anläggningen (röntgenfri elektronlaser) i Tyskland, att analysera vinkelkorrelationer från experimentdata och använda CAMERAs multi-tiered iterative phasing (M-TIP) algoritm för att utföra de första framgångsrika 3D-virusrekonstruktionerna från experimentella korrelationer. Resultaten beskrevs i en artikel publicerad 12 oktober Fysiska granskningsbrev .

"Under de senaste 40 åren, detta ansågs vara ett problem som inte kunde lösas, sade Peter Zwart, medförfattare på tidningen och en fysikalisk biovetare som är medlem i CAMERA baserad på Molecular Biophysics and Integrated Imaging Division vid Berkeley Lab. "Men det visar sig att de matematiska verktyg som vi utvecklat kan dra nytta av extra information gömd i problemet som tidigare förbisetts. Det är glädjande att se vårt teoretiska förhållningssätt leda till ett praktiskt verktyg."

Nya forskningsmöjligheter aktiverade av XFELs

Under stora delar av förra seklet, Go-to-tekniken för att bestämma högupplöst molekylstruktur har varit röntgenkristallografi, där provet av intresse arrangeras i ett stort periodiskt gitter och exponeras för röntgenstrålar som sprids och bildar diffraktionsmönster som samlas på en detektor. Även om kristallografi har varit framgångsrik när det gäller att bestämma många högupplösta strukturer, det är utmanande att använda denna teknik för att studera strukturer som inte är mottagliga för kristallisation eller strukturella förändringar som inte förekommer naturligt i en kristall.

Skapandet av XFEL-anläggningar, inklusive Linac Coherent Light Source (LCLS) och den europeiska X-FEL, har skapat möjligheter för att genomföra nya experiment som kan övervinna begränsningarna med traditionell kristallografi. Särskilt, XFEL-strålar är flera storleksordningar ljusare än och har mycket kortare pulslängder än traditionella röntgenljuskällor, som tillåter dem att samla in mätbar diffraktionssignal från mindre okristalliserade prover och även studera snabb dynamik. Enpartikeldiffraktion är en sådan framväxande experimentell teknik som möjliggörs av XFELS, där man samlar diffraktionsbilder från enstaka molekyler istället för kristaller. Dessa enpartikeltekniker kan användas för att studera molekylär struktur och dynamik som har varit svåra att studera med traditionella avbildningstekniker.

Att övervinna begränsningar i enpartikelavbildning via vinkelkorrelationer

En stor utmaning med enpartikelavbildning är orienteringsbestämningen. "I ett experiment med en partikel, du har inte kontroll över rotationen av partiklarna eftersom de träffas av röntgenstrålen, så varje ögonblicksbild från en lyckad träff kommer att innehålla information om provet från en annan orientering, " sa medförfattaren Jeff Donatelli, en tillämpad matematiker i CAMERA som utvecklade många av algoritmerna i det nya ramverket. "De flesta metoder för analys av en partikel har hittills varit baserade på att försöka bestämma dessa partikelorienteringar från bilderna; den bästa upplösningen som kan uppnås från dessa analyser begränsas av hur exakt dessa orienteringar kan bestämmas från brusiga data."

Istället för att direkt bestämma dessa inriktningar, teamet tog ett annat tillvägagångssätt baserat på idé som ursprungligen föreslogs på 1970-talet av Zvi Kam. "Istället för att undersöka de individuella dataintensiteterna i ett försök att hitta den korrekta orienteringen för varje uppmätt ram, vi eliminerar detta steg helt och hållet genom att använda så kallade korskorrelationsfunktioner, sa Kurta.

Detta tillvägagångssätt, känd som fluktuationsröntgenspridning, bygger på att analysera vinkelkorrelationerna för ultrakort, intensiva röntgenpulser spridda från icke-kristallina biomolekyler. "Det fina med att använda korrelationsdata är att det innehåller ett omfattande fingeravtryck av 3D-strukturen hos ett objekt som utökar traditionella lösningsspridningsmetoder, " sa Zwart.

Rekonstruera 3D-struktur från korrelationer med CAMERAs M-TIP-algoritm

Teamets genombrott i att rekonstruera 3D-struktur från korrelationsdata möjliggjordes av multi-tiered iterative phasing (M-TIP) algoritm som utvecklats av CAMERA. "Bland de framträdande fördelarna med M-TIP är dess förmåga att lösa strukturen direkt från korrelationsdata utan att behöva förlita sig på några symmetribegränsningar, och, mer viktigt, utan att behöva lösa problemet med orienteringsbestämningen, sa Donatelli.

Donatelli, CAMERA-direktören James Sethian och Zwart utvecklade sitt M-TIP-ramverk genom att utveckla en matematisk generalisering av en klass av algoritmer som kallas iterativ fasningsteknik, som används för att bestämma struktur i ett enklare problem, känd som fasåtervinning. Ett dokument som beskriver det ursprungliga M-TIP-ramverket publicerades augusti 2015 i Proceedings of the National Academy of Sciences .

"Avancerade korrelationsanalyser i kombination med ab-initio rekonstruktioner av M-TIP definierar tydligt en effektiv väg för strukturell analys av objekt i nanoskala vid XFELs, " sa Zwart.

Framtida riktningar för korrelationsanalys och M-TIP

Teamet noterar att metoder som används i denna analys också kan användas för att analysera diffraktionsdata när det finns mer än en partikel per skott.

"De flesta algoritmer för enpartikelavbildning kan bara hantera en molekyl åt gången, vilket begränsar signal och upplösning. Vårt tillvägagångssätt, å andra sidan, är skalbar så att vi också ska kunna mäta mer än en partikel åt gången, " sa Kurta. Avbildning med mer än en partikel per skott kommer att göra det möjligt för forskare att uppnå mycket högre träfffrekvens, eftersom det är lättare att använda en bred stråle och träffa många partiklar samtidigt, och kommer också att undvika behovet av att skilja ut enpartikelträffar från flerpartikelträffar och blankskott, vilket är ett annat utmanande krav i traditionell enpartikelavbildning.

Som en del av CAMERAs svit av beräkningsverktyg, de har också utvecklat en annan version av M-TIP som löser orienteringsproblemet och kan klassificera bilderna i konformationella tillstånd, och kan följaktligen användas för att studera små biologiska skillnader i det uppmätta provet. Denna alternativa version av M-TIP beskrevs i en artikel publicerad 26 juni 2017 i Proceedings of the National Academy of Sciences och är en del av ett nytt samarbetsinitiativ mellan SLAC National Accelerator Laboratory, KAMERA, the National Energy Research Scientific Computing Center (NERSC) and Los Alamos National Laboratory as part of DOE's Exascale Computing Project (ECP).