Cellinjer injicerade med fri nukleinsyra används i stor utsträckning för läkemedelsupptäckt och sjukdomsmodellering. För att undvika genetiskt blandade cellpopulationer, utredare använder spädningstekniker för att välja enstaka celler som sedan kommer att generera identiska linjer. Dock, vägen för att begränsa utspädningar är tråkig och tidskrävande.

En ny studie av forskare från Northwestern visar hur Nanofountain Probe Electroporation (NFP-E), ett verktyg som levererar molekyler till singelceller, skulle kunna lösa det problemet, och kan leda till nya tillämpningar för läkemedelsscreening och utformning av patientspecifika behandlingsförlopp.

Laget, ledd av Northwestern Engineerings Horacio Espinosa och inklusive Joshua Leonard, demonstrerar mångsidigheten hos NFP-E – som introducerar DNA eller RNA i celler med hjälp av elektricitet. Den kan också leverera både proteiner och plasmider i en mängd olika djur- och mänskliga celltyper med doskontroll. Teamet inkluderade John Kessler, Ken och Ruth Davee professor i stamcellsbiologi och professor i neurologi och farmakologi vid Northwestern University Feinberg School of Medicine.

Den nya metoden kan användas för att studera sjukdom eller för cellterapi. I det förra, genomet manipuleras. I det senare, Genredigering sker i celler som T-celler för att behandla cancer med immunterapier.

Genom att använda encellselektroporering, processen att introducera DNA eller RNA i enstaka celler med hjälp av en puls av elektricitet, som kort öppnar porerna i cellmembranet, deras arbete visar hur NFP-E uppnår fin kontroll över det relativa uttrycket av två samtransfekterade plasmider. Dessutom, genom att para encellselektroporation med time-lapse fluorescerande avbildning, deras undersökning avslöjar karakteristiska tider för stängning av elektroporer.

"Vi demonstrerade potentialen hos NFP-E-tekniken för att manipulera en mängd olika celltyper med stökiometrisk kontroll av molekylär last som kan användas för att genomföra ett brett utbud av studier inom läkemedelsscreening, cellterapier, och syntetisk biologi, sa Espinosa, James N. och Nancy J. Farley Professor i tillverkning och entreprenörskap och professor i maskinteknik och (med tillstånd) biomedicinsk teknik och civil- och miljöteknik.

För närvarande, biomolekyler kan levereras till celler på många sätt:virala vektorer; kemiska bärare, såsom cellpenetrerande peptider och polymernanokapslar; lipofektamin, och bulkelektroporering.

"Det finns ett antal strategier för att leverera biomolekyler till celler, men var och en har sina begränsningar, sa Leonard, docent i kemisk och biologisk teknik och Charles Deering McCormick professor i undervisningsexcellens. "Till exempel, kemiska bärare ger relativt långsam leverans och kan vara toxiska för cellen; virala vektorer är ofta effektiva men kan inducera ogynnsamma immunsvar och insättningsgentoxicitet. Användning av vilken traditionell metod som helst kräver ofta stor ansträngning för att optimera protokollet beroende på celltyp och molekyl som ska levereras, och, därför, en lätt generaliserbar biomolekylleveransstrategi skulle erbjuda några meningsfulla fördelar."

Det nya NFP-E-systemet möjliggör encellsleverans av DNA, RNA, och proteiner till olika immortaliserade cellinjer såväl som primära celler med mer än 95 procent effektivitet och mer än 90 procent cellviabilitet.

"Resultaten indikerar att cellmembranets återförslutningstid skalar icke-linjärt med pulsspänningen och antalet elektroporationspulser, nå ett maximum vid mellanliggande värden, ", sa Espinosa. "Det betyder långa pulseringstider eller höga spänningar verkar inte vara nödvändiga för effektiv molekylär transport över cellmembran. Den funktionen är viktig för att uppnå hög transporteffektivitet samtidigt som celltoxiciteten hålls till ett minimum."

Genom att använda encellselektroporationsteknik, forskarna kunde förstå transportmekanismer involverade i lokaliserad elektroporationsbaserad cellprovtagning. Ett hinder för oförstörande temporal encellsprovtagning är de små mängderna cytosol - vätskan inuti cellerna - som extraheras, vilket gör det utmanande att testa eller detektera RNA-sekvenser eller proteiner.

Forskning visade att skalningen av membranets återförslutningstid är en funktion av olika elektroporationsparametrar, ger insikt i post-puls elektro-pordynamik.

"Arbetet tar upp behovet av att förstå sätt att öka mängden cytosolprov, utan att påverka cellerna negativt, ", sa Espinosa. "Det kan vägleda forskarsamhället i att utforma experiment som syftar till elektroporationsbaserad provtagning av intracellulära molekyler för tidscellsanalys."

Denna forskning är relaterad till tidigare arbete som utvecklat en minimalt invasiv metod för att ta prov på celler som kan upprepas flera gånger. Den tidigare utredningen, som använde elektriska pulser för att extrahera enzymer från cytosolen, assisterad förståelse av kinetiken för porbildning och förslutning.

Pappret, "Nanofountain Probe Electroporation Enables Versatile Single-Cell Intracellular Delivery and Investigation of Postpulse Electropore Dynamics" publicerades den 2 oktober i tidskriften Små .