SMU nanoteknikexperten MinJun Kim hjälpte ett team av forskare vid University of Texas i Austin att utveckla ett billigare sätt att upptäcka nukleasspjälkning - ett av de kritiska stegen i många nukleinsyraavkänningsapplikationer, som de som används för att identifiera covid-19.
Nukleinsyradetektering är den primära metoden för att identifiera patogener som orsakar infektionssjukdomar. Eftersom miljontals PCR-tester kördes över hela världen varje dag under covid-19-pandemin är det viktigt att minska kostnaderna för dessa tester.
En studie publicerad i tidskriften Nature Nanotechnology visar att detta lågkostnadsverktyg, kallat Subak, är effektivt för att berätta när nukleasnedbrytning har inträffat, vilket är när ett enzym som kallas nukleas bryter ner nukleinsyror, såsom DNA eller RNA, till mindre fragment.
Det traditionella sättet att identifiera nukleasaktivitet, Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)-sonden, kostar 62 gånger mer att producera än Subak-reportern.
"Subak-reportern är mer kostnadseffektiv och enklare än FRET-baserade system, och erbjuder en alternativ metod för att detektera nukleasaktivitet", säger Kim, Robert C. Womack-ordförande vid Lyle School of Engineering vid SMU och huvudutredare för BAST Lab . "Många nukleinsyradetekteringsmetoder idag, såsom PCR och DETECTR, är fortfarande beroende av användningen av FRET-sonder i sina sista steg."
Till skillnad från PCR är DETECTR (DNA-endonukleas-riktad CRISPR-transreporter) en enklare analys, eller test, som förlitar sig på CRISPR-Cas-nukleas för patogen DNA-detektion. Kim och forskarna vid UT Austin har framgångsrikt ersatt FRET-sonden med Subak-reportern i DETECTR-analysen, vilket avsevärt har minskat analyskostnaden.
Subak-reportrar är baserade på en speciell klass av vad som kallas fluorescerande silvernanokluster. De består av 13 silveratomer lindade runt en kort DNA-sträng – ett organiskt/oorganiskt sammansatt nanomaterial som är för litet för att vara synligt för blotta ögat och som varierar i storlek från 1 till 3 nanometer (en miljarddels meter) i storlek .
Nanomaterial i denna längdskala kan vara mycket självlysande, såsom kvantprickar, och uppvisa olika färger. Fluorescerande nanomaterial har funnits i TV-skärmar och i biosensing, såsom Subak-reportern.
Ledande forskare Tim Yeh, en docent i biomedicinsk teknik vid Cockrell School of Engineering vid UT Austin, och hans team programmerade Subak-reportrarna att avge en annan färg när de smälts av nukleaser.
"Dessa DNA-mallade silvernanokluster avger initialt grön fluorescens, men genomgår en anmärkningsvärd färgväxling till klarrött när DNA fragmenteras av nukleaser," sa Kim. "Färgförändringen hos Subak-reportrar är lätt att se under en UV-lampa", även om själva enheten är mycket liten.
Subak-reportrar kostar bara $1 per nanomolekyl att göra. Däremot kostar FRET – som kräver att man använder olika fluorescerande färgämnen som kräver mer för att få resultat – $62 per nanomolekyl att producera, sa Kim.
Kim och Madhav L. Ghimire, SMU:s dekanus postdoktor vid SMU:s Moody School of Graduate and Advanced Studies, arbetade med Yeh för att optimera och karakterisera DNA/AgNC silver nanokluster. Detta inkluderade att öka intensiteten av den gröna och röda fluorescensen före och efter fragmentering av nukleaser.
Karakterisering innebar att bekräfta storleken, strukturen och stabiliteten hos nanoklustren i specifika miljöer.
"Optimering av dessa lågkostnadsdetektorer är avgörande för att övervaka deras fluorescensegenskaper, säkerställa nanoklustrets stabilitet, kontrollera storlek och struktur, och viktigast av allt för att förbättra deras känslighet och selektivitet under olika miljöförhållanden, vilket gör dem mer tillförlitliga för avkänningsändamålet," Ghimire sa.
Förutom ytterligare testning av Subak-reportern för nukleasnedbrytning, vill teamet också undersöka om det kan vara en sond för andra biologiska mål.
Mer information: Hong, S. et al, En icke-FRET DNA-reporter som ändrar fluorescensfärg vid nukleasdigestion. Nanoteknik i naturen (2024). DOI:10.1038/s41565-024-01612-6
Tillhandahålls av Southern Methodist University
