Membranet som omsluter en biologisk cell är inte bara en barriär; den är proppfull av proteiner involverade i alla möjliga kritiska biologiska funktioner. För att verkligen förstå vad membranproteiner gör och hur måste forskare veta hur de är organiserade och hur de interagerar med varandra. Men att avslöja den informationen är en utmaning.
Yale-forskare har nu utvecklat en ny mikroskopimetod kallad Native-nanoBleach som övervinner de största utmaningarna för att förstå membranproteinorganisation, inklusive svårigheten att studera dessa membran utan att störa den naturliga miljön och gränser för upplösningen hos ljusmikroskop som vanligtvis används för att studera dem.
Och för att demonstrera effektiviteten av den nya metoden tillämpade de den framgångsrikt på en biologisk gåta – angående proteiner som är involverade i utvecklingen av cancer i bukspottkörteln och hur de kan riktas mot behandling – som har förblivit olöst i decennier.
De beskriver den nya metoden och dess fördelar i en ny studie publicerad i Nature Nanotechnology .
Metoder som vanligtvis används i studien av membranproteinorganisation kräver att man tar bort den naturliga membranmiljön som omger proteiner och sedan placerar isolerade proteiner av intresse i miljöer som efterliknar men inte helt replikerar komplexiteten hos det verkliga cellmembranet, säger Moitrayee Bhattacharyya, biträdande professor i farmakologi. vid Yale School of Medicine och senior författare till studien. Detta tillvägagångssätt, sade Bhattacharyya, tar bort viktiga sammanhang eftersom proteinerna interagerar med molekylerna som omger dem.
För det andra har ljusmikroskop, som vanligtvis används för att observera proteinorganisation, inte den upplösning som behövs för att avgöra om proteiner nära varandra verkligen interagerar eller helt enkelt är grannar på membran.
Slutligen kan mängden av ett visst protein som finns i ett cellmembran vara för lågt eller för högt för nuvarande studiemetoder. I dessa fall måste forskarna göra justeringar; de måste antingen replikera proteiner som i sitt naturliga tillstånd är för få till antalet eller separera proteiner från prover där det finns för många. Men detta kan återigen ta bort viktiga sammanhang om det naturliga tillståndet hos proteiner när de sitter och fungerar i cellmembran.
"Helst skulle vi ha en metod som skulle fungera med alla endogena nivåer av cellmembranproteinuttryck," sa Bhattacharyya.
För att ta itu med den första utmaningen använde forskarna särskilda molekyler, typer av polymerer, för att i huvudsak slå ut proteinkomplex med deras omgivande cellmembran intakt. "Det är som att cellmembranet är ett ark av kakdeg och polymererna är kakskärare", sa Bhattacharyya.
Dessa bitar av protein med omgivande cellmembran, kallade infödda nanoskivor, är cirka 10 nanometer i diameter, tillräckligt små för att eventuella proteiner som finns i nanoskivan sannolikt interagerar, vilket löser den andra utmaningen. Vidare fungerar detta tillvägagångssätt med vilket cellmembranprotein som helst i vilken mängd som helst, vilket gör att forskare kan observera proteiner på deras naturliga nivåer i inhemska membran.
När nanoskivorna har genererats kan forskare använda valfritt antal vanliga tekniker för att finslipa på ett visst protein av intresse. De kvantifierar sedan proteinerna i varje nanoskiva med hjälp av fluorescerande molekyler fästa vid dem.
Det är ett tillvägagångssätt som erbjuder hög rumslig upplösning utan behov av specialiserad hårdvara, sa Bhattacharyya.
"Detta arbete presenterar en ny teknik för att förstå hur membranproteiner - som representerar cirka 60% av läkemedelsmålen - sätts ihop till funktionella enheter på eller inom det naturliga lipiddubbelskiktet", säger Gerard Walker, medförfattare till uppsatsen och doktorand. i Bhattacharyyas labb.
För att visa hur denna metod kan tillämpas tog forskarna en decennier lång debatt inom biologi. Ett protein som kallas KRas är muterat i mer än 90 % av humana pankreascancer, vilket väcker enormt kliniskt och terapeutiskt intresse. Huruvida KRas subenheter kommer samman för att bilda dimerer (två enheter) eller oligomerer (mer än två enheter) på cellmembran har förblivit i fokus för långvarig undersökning.
Studier har dock gett motstridiga resultat. Djur- och cellulära studier, som saknar detaljerad molekylär upplösning, visar bevis på att KRas-enheter möts på cellmembran. Samtidigt har biofysiska analyser, som inte behåller det naturliga membranet runt proteiner, funnit att KRas finns kvar i enstaka enheter, eller monomerer.
"Med vår metod får vi det bästa av två världar", sa Bhattacharyya. "Vi behåller den naturliga membranmiljön och vi har mycket hög rumslig och enmolekylär upplösning. När vi tillämpade vår metod fann vi att KRas existerar som dimerer och monomerer i liknande mängder. Men när KRas är muterad, som i cancer i bukspottkörteln, dimerer ökar och monomerer minskar."
Upptäckten belyser vikten av det naturliga cellmembranet för att förstå membranproteiner och identifierar ett mål - vilket minskar KRas dimerisering - för cancerbehandling. Detta är bara ett av många sätt som den här metoden kan användas för att förstå rollen av membranproteinorganisation i sjukdomar, sa Bhattacharyya.
"Det är verkligen givande att se Native-nanoBleach som redan framgångsrikt tillämpas på en mängd olika angelägna biologiska frågor i Bhattacharyya-labbet och bortom", säger Caroline Brown, medförfattare till studien och en doktorsexamen. kandidat i labbet av medförfattaren Kallol Gupta, biträdande professor i cellbiologi.
Membranproteiner utgör en tredjedel av alla proteiner i människokroppen och detta tillvägagångssätt kan användas för att studera vilket som helst av dem, sa Bhattacharyya.
"Det är en allmän teknik", sa hon. "Det finns egentligen ingen begränsning."
Framöver hoppas Bhattacharyya och hennes kollegor kunna utöka detta tillvägagångssätt för att studera proteinorganisation i membranen i olika organeller, strukturer, som mitokondrier, som finns i celler.
Mer information: Gerard Walker et al, Oligomer organisation av membranproteiner från inhemska membran vid rumslig och enkelmolekylär upplösning i nanoskala, Nature Nanotechnology (2023). DOI:10.1038/s41565-023-01547-4
Journalinformation: Nanoteknik i naturen
Tillhandahålls av Yale University
