Forskare vid McKelvey School of Engineering vid Washington University i St. Louis har banat väg för en ny teknik som kommer att möjliggöra högupplöst avbildning av mycket små föremål som nervceller. Tekniken, som förbättrar en befintlig metod som kallas expansionsmikroskopi, beskrivs i en ny artikel publicerad i tidskriften Nano Letters .
De flesta är bekanta med mikroskop som använder linser för att få ett föremål att verka större och lättare att se med det mänskliga ögat. Men expansionsmikroskopi (ExM) fungerar på praktiskt taget motsatt sätt - genom att göra själva objektet större. Forskare täcker provet - en cell, till exempel - med små ljusavgivande markörer som kallas fluoroforer, och bäddar sedan in provet i en gel som expanderar när det kommer i kontakt med vatten. När provet växer sig större spårar de fluorescerande etiketterna konturerna av särdrag som är för små för att ses, som de tunna grenarna eller dendriterna som växer från hjärnceller.
Men expansionsmikroskopi har en stor brist. Ljussignalen som emitteras av konventionella fluoroforer förlorar mycket av sin intensitet (mer än 50 %) under förberedelse- och expansionsstegen.
"När du gör saker större är det inte nödvändigtvis bra, för om du inte ändrar mängden signal som redan finns så blir den signalen svagare", säger Barani Raman, professor i biomedicinsk teknik.
Raman och Srikanth Singamaneni, Lilyan &E. Lisle Hughes professor vid institutionen för maskinteknik och materialvetenskap, har tagit itu med denna fråga genom att använda ultraljusa fluorescerande markörer som kallas plasmonic-fluors (PF). Singamaneni utvecklade PF:erna för andra applikationer 2020.
"Det är ett bra exempel på två personer med helt olika expertis som har en chanskonversation och säger "Okej, det här problemet finns här inom ett område, men lösningen finns inom ett annat område", sa Raman. Teamet har kallat sin nya teknik "plasmonförstärkt expansionsmikroskopi" eller p-ExM.
Plasmon-fluoret är konstruerat av en kärnpartikel av guld insvept i ett silverskal, som sedan täcks med ett lager av andra material, inklusive konventionella fluoroforer. Strukturen är utformad för att skydda fluoroforerna från de starka kemikalier som används i processen och för att göra ljussignalen från fluoroforerna mycket ljusare. Tekniken kommer att hjälpa forskare att kartlägga neurala nätverk, eller kopplingarna mellan neuroner.
"Metalnanopartikeln fungerar som en antenn, vilket innebär att den kan dra in mer ljus i fluoroforerna," sa Singamaneni. Interaktionen mellan guld-silver nanopartikeln och fluoroforerna gör också att fluoroforerna sänder ut fler fotoner än de normalt skulle göra. Som ett resultat är plasmonfluoret nästan fyra storleksordningar ljusare än vad de fluorescerande markörerna skulle vara på egen hand. Plasmoniska fluorämnen löser också problemet med signalutspädning eftersom de fluorescerande markörerna är fästa direkt på nanopartikeln, så att de inte sprids isär när provet expanderar.
För att demonstrera potentialen för plasmonförstärkt expansionsmikroskopi använde forskarna den för att studera ett prov av neuroner från hippocampusregionen i hjärnan. I vissa fall är neuronens spirande grenar, kallade neuriter, för nära varandra för att kunna urskiljas utan hjälp av tekniker som expansionsmikroskopi.
"När två neuriter är för nära varandra kan vi inte lösa dem. Programvaran tror att de bara är en neurit", sa Singamaneni.
Efter att ha märkt cellerna med de ultraljusa plasmoniska fluorerna och utökat provet kunde teamet räkna antalet neuriter, kvantifiera den totala arean av neuriterna och mäta längden på individuella neuriter. De identifierade 2,5 gånger fler neuritterminaler än vad som var synligt innan provet expanderades.
När teamet jämförde plasmonic-fluorens prestanda med fluoroforerna själva, fann de att plasmonic-fluoren behöll cirka 76 % av ljussignalen medan fluoroforerna behöll mindre än 16 %. Teamets resultat visade också att plasmonförstärkt expansionsmikroskopi är kompatibel med befintliga expansionsmikroskopiprotokoll, vilket innebär att plasmoniska fluorer kan användas i stället för konventionella fluoroforer i framtida studier. PF kan också skapas från vilken fluorofor som helst som passar forskarnas behov.
Mer information: Priya Rathi et al, Plasmon-Enhanced Expansion Microscopy, Nano Letters (2023). DOI:10.1021/acs.nanolett.3c01256
Journalinformation: Nanobokstäver
Tillhandahålls av Washington University i St. Louis
