I kemiska reaktioner som katalyseras av ett enzym sänker enzymet mängden aktiveringsenergi som krävs genom att temporärt binda med substratet och vrida den i ett ansträngt tillstånd. K (katalysatorn) eller "kcat" för reaktionen avser den koncentrationsoberoende konstanten för den hastighet vid vilken ett visst enzym kan metabolisera ett substrat i en produktmolekyl. För att beräkna kcat blandar forskare först flera provrör med olika koncentrationer av substrat (känd som en "enzymatisk analys") och test dem med konstanta tidsintervaller med en ljusspektrofotometer för att mäta växande koncentrationer av produktmolekyler. Dessa data plottas sedan på ett diagram och analyseras.
Beräkning av initialhastigheter
Skriv ett diagram över produktkoncentrationen mot tiden för data från den enzymatiska analysens första provrör. Obs! Den horisontella axeln ska vara "time" och den vertikala axeln ska vara "produktkoncentration".
Beräkna den linjära regressionslinjen för de datapunkter du skrev i avsnitt 1, steg 1. Med Excel och diagram kalkylatorer kan enkelt bestämma denna linjära modell. Du kan härleda en uppskattning av regressionslinjens lutning genom att dividera skillnaden i produktkoncentration mellan intilliggande datapunkter med sin tidsskillnad.
Spela in linjärregressionslinjens lutning från Avsnitt 1, Steg 2 som "inledande reaktionshastighet (Vo)." Obs! I regressionsmodellen "[produktkoncentration] = m [tid] + b" är koefficienten "m" höjden.
Upprepa steg 1, 2 och 3 för resten av provrören i analysen.
Beräkning av Vmax
Avbilda den inversa substratkoncentrationen för varje provrör kontra invers av sin initiala reaktionshastighet (från avsnitt 1, steg 4). Om till exempel initialhastigheten för ett provrör med en initial substratkoncentration av 50 mikromolar (uM) var 80 uM /s, skulle inverserna vara 1/50 uM för substratkoncentrationen och 1/80 uM /s för den initiala hastighet. Obs! Den inversa substratkoncentrationen ska ligga på den horisontella axeln och den inversa initialhastigheten ska ligga på den vertikala axeln.
Obs: substratkoncentrationen ska ligga på den horisontella axeln och initial reaktionshastighet bör ligga på vertikal axel.
Bestäm linjär regressionslinje för diagrammet du skrev i avsnitt 2, steg 1. Obs! eftersom du måste känna y-skärningen för regressionslinjen bör du ange punkterna från avsnittet 2, Steg 1 i antingen Excel eller en grafisk räknare och använd den inbyggda regressionsmodellfunktionen.
Dela 1 med y-skärningen från den linjära regressionslinjen. Detta ger dig värdet av inversen av Vmax, den maximala reaktionshastigheten för enzymet. Obs! Om den linjära regressionsmodellen tar formen "[Inverse Vo] = m [Inverse Substrate Conc.] + B", då skulle värdet av "b" vara y-korsningen. Dela 1 med "b" för att beräkna inversen av Vmax.
Dela 1 med resultatet från avsnitt 2, steg 3 för att beräkna det verkliga värdet av Vmax.
Bestäm enzymets koncentration i den ursprungliga analysen (se rådata). Obs! Enzymkoncentrationen är densamma för alla provrören. endast substratkoncentrationerna varierar i analysen.
Dela Vmax (från avsnitt 2, steg 4) med enzymkoncentrationen (från avsnitt 2, steg 5). Resultatet är värdet av Kcat.
