1. Extrahera DNA från cellen:
- Använd en cellysbuffert eller ett DNA-extraktionskit för att bryta upp cellmembranet och frigöra dess innehåll.
- Separera DNA från andra cellulära komponenter genom metoder som centrifugering eller utfällning.
2. Rena DNA:
- Ta bort föroreningar som proteiner och RNA med hjälp av enzymatiska behandlingar (t.ex. proteinas K, RNase A) eller reningstekniker (t.ex. fenol-kloroformextraktion, kolonnkromatografi).
3. Spjäl DNA till fragment:
- Behandla DNA:t med restriktionsenzymer för att skära det i mindre, definierade fragment.
- Välj restriktionsenzymer som känner igen och klyver specifika DNA-sekvenser.
4. Storleksfraktionera DNA-fragmenten:
- Separera DNA-fragmenten baserat på deras storlek med hjälp av tekniker som gelelektrofores eller storleksuteslutningskromatografi.
5. Ligera DNA-fragment till vektorer:
- Kombinera DNA-fragment med klonings- eller expressionsvektorer som innehåller väsentliga sekvenser för DNA-replikation och uttryck i värdorganismer.
- Ligera DNA-fragmenten i vektorerna med hjälp av DNA-ligas.
6. Transformera eller transfektera de rekombinanta vektorerna:
- Introducera de rekombinanta vektorerna i värdceller (bakterier, jäst, djurceller) genom tekniker som transformation (bakterier), transfektion (eukaryota celler) eller elektroporation.
7. Välj och klona celler med de önskade DNA-fragmenten:
- Odla de transformerade eller transfekterade cellerna och välj de som framgångsrikt har integrerat de rekombinanta vektorerna som innehåller DNA-fragmenten av intresse.
- Klona dessa celler för att erhålla klonala populationer som bär de önskade DNA-insättningarna.
8. Utöka och isolera klonala populationer:
- Öka de klonala populationerna för att utöka antalet celler som innehåller DNA-fragmenten.
- Isolera DNA från dessa klonala populationer.
9. Verifiera närvaron och integriteten hos DNA-fragmenten:
- Analysera det isolerade DNA:t med hjälp av restriktionsenzymdigestion, gelelektrofores eller sekvensering för att bekräfta närvaron och strukturell integritet hos DNA-fragmenten.
10. Föröka och bibehålla de önskade DNA-konstruktionerna:
- Föröka och underhålla de klonala populationerna eller DNA-konstruktionerna som innehåller de önskade DNA-fragmenten för vidare analys, forskning eller biotekniska tillämpningar.
Genom att följa dessa steg kan du framgångsrikt skapa kromosomer från DNA-fragment, så att du kan studera, manipulera eller använda specifika DNA-sekvenser av intresse.
