1. Minimera enzymaktivitet:
- Många enzymer, särskilt proteaser, är temperaturkänsliga och deras aktivitet ökar vid högre temperaturer. Att hålla lysbufferten och cellsuspensionen kallt minskar enzymaktiviteten avsevärt, vilket förhindrar nedbrytning av proteiner och nukleinsyror. Detta är särskilt viktigt för att isolera intakta proteiner eller extrahera RNA av hög kvalitet.
2. Konservering av cellulära komponenter:
- Cellmembran består av lipider, som blir mer flytande vid högre temperaturer. Denna fluiditet ökar risken för membranbrott och läckage, vilket leder till förlust av cellulära komponenter som organeller och makromolekyler. Kalla förhållanden upprätthåller membranintegritet och förhindrar oönskad frisättning.
3. Minska nedbrytning av biomolekyler:
- Nukleaser (enzymer som bryter ned nukleinsyror) är också temperaturkänsliga. Kalla förhållanden hjälper till att minimera deras aktivitet, skydda DNA och RNA från nedbrytning under lysering.
4. Saktar ner cellulära processer:
- Metaboliska processer i celler fortsätter även efter lysering. Genom att hålla lysatet kallt bromsar du dessa processer, minimerar ytterligare nedbrytning av cellulära komponenter och säkerställer en mer exakt representation av cellulärt tillstånd.
5. Underlätta proteinaggregering:
- I vissa fall kan kalla temperaturer faktiskt underlätta aggregeringen av vissa proteiner, vilket kan vara önskvärt för nedströmsapplikationer som proteinrening eller kristallisation.
Specifika överväganden:
- Den specifika temperatur som används (t.ex. 0 ° C eller 4 ° C) beror på det specifika experimentet och känsligheten hos målbiomolekylerna.
- Användningen av proteashämmare i lysbufferten kan ytterligare minimera proteinnedbrytning, även vid varmare temperaturer.
Sammanfattningsvis är att använda ett iskallt tillstånd under celllys ett avgörande steg för att upprätthålla integriteten hos cellulära komponenter, förhindra oönskad nedbrytning av biomolekyler och säkerställa en mer exakt representation av celltillståndet.
