Metoder för att isolera fria aminosyror från proteiner
1. hydrolys:
* Syrahydrolys: Den vanligaste metoden. Starka syror (som HCl) används för att bryta peptidbindningarna i proteinet och frigöra de enskilda aminosyrorna.
* Förfarande:
* Proteinprov behandlas med koncentrerad HCl (vanligtvis 6M) vid höga temperaturer (100-110 ° C) under 12-24 timmar.
* Denna process klyver alla peptidbindningar och befriar fria aminosyror.
* Efter hydrolys avlägsnas syran genom indunstning, vilket lämnar aminosyran.
* Fördelar: Effektiv, relativt enkel.
* Nackdelar: Kan leda till aminosyrededbrytning, särskilt tryptofan. Vissa aminosyror som cystein kan förstöras eller modifieras.
* enzymatisk hydrolys: Använder specifika enzymer (som proteaser) för att bryta ner proteiner i peptider och i slutändan fria aminosyror.
* Förfarande:
* Specifika enzymer väljs baserat på proteinets struktur och det önskade resultatet.
* Inkubation med enzymet vid optimala förhållanden möjliggör kontrollerad nedbrytning.
* Fördelar: Milder förhållanden, mindre nedbrytning, kan vara mer selektiva.
* Nackdelar: Kan vara dyrare, långsammare än sur hydrolys.
2. separation och rening:
* kromatografi:
* jon-utbyteskromatografi: Separerar aminosyror baserat på deras laddning.
* Storleksuteslutningskromatografi: Separerar aminosyror baserat på deras storlek.
* Högpresterande vätskekromatografi (HPLC): Mycket känslig och exakt metod för att separera och kvantifiera aminosyror.
* elektrofores: Separerar aminosyror baserat på deras laddning och storlek.
Överväganden:
* Proteinkälla: Den typ av protein du börjar med kommer att påverka den bästa metoden.
* önskat resultat: Vill du helt enkelt identifiera närvaron av fria aminosyror, eller behöver du kvantifiera dem?
* Känslighet: Nivån på känslighet som krävs i analysen.
* Kostnad och utrustning: Tänk på tillgängliga resurser.
Allmänt arbetsflöde:
1. Proteinberedning: Isolera och rena intresset.
2. hydrolys: Välj lämplig hydrolysmetod (syra eller enzymatisk).
3. Separation och rening: Välj och optimera metoden för att separera och isolera de fria aminosyrorna.
4. Identifiering och kvantifiering: Använd tekniker som kromatografi, elektrofores eller andra analysmetoder för att identifiera och kvantifiera de fria aminosyrorna.
Viktig anmärkning: De specifika procedurerna och förhållandena för att isolera fria aminosyror från proteiner kommer att variera beroende på proteinkällan, önskat resultat och tillgängliga resurser.
