1. Celllys:
* bryter upp cellerna: Detta är det första steget, där cellmembranet och kärnmembranet störs för att frigöra DNA.
* Mekaniska metoder: Dessa inkluderar användning av en mixer (för större prover), sonikering (med ljudvågor) eller slipning av cellerna (för vävnader).
* kemiska metoder: Med användning av tvättmedel (som SDS) eller enzymer (som lysozym) för att bryta ner cellmembranen.
2. DNA -isolering:
* separera DNA från andra cellulära komponenter: Efter lysering innehåller blandningen DNA, proteiner, lipider och annat cellulärt skräp.
* enzymatisk matsmältning: Enzymer som proteinas K används för att bryta ner proteiner, vilket ytterligare separerar DNA från andra cellulära komponenter.
* Saltutfällning: Att tillsätta saltlösningar som natriumklorid kan få DNA att fälla ut ur lösningen, medan andra cellulära komponenter förblir upplösta.
* organisk extraktion: Användning av organiska lösningsmedel som fenolkloroform för att separera DNA från proteiner och andra cellulära komponenter. DNA förblir i vattenfasen, medan de andra komponenterna extraheras i den organiska fasen.
3. DNA -rening:
* Ta bort föroreningar: Efter isolering kan DNA fortfarande innehålla föroreningar som RNA eller proteiner.
* Etanolutfällning: Att lägga till etanol till lösningen får DNA att fälla ut, vilket möjliggör ytterligare rening.
* Kolumnkromatografi: Använd specialiserade kolumner med specifika hartser som binder till DNA, vilket möjliggör selektivt avlägsnande av föroreningar.
4. DNA -lagring:
* lagring av det renade DNA: Det isolerade DNA kan lagras i buffertar vid specifika temperaturer för långvarig användning.
Ytterligare överväganden:
* Typ av cell: Metoden som används beror på vilken typ av cell som studeras, till exempel är bakterieceller lättare att lysa än däggdjursceller.
* Kvantitet DNA som behövs: Mängden DNA som behövs kommer att påverka den valda metoden.
* nedströms applikationer: Den avsedda användningen av DNA (t.ex. sekvensering, PCR, kloning) kan kräva specifika reningssteg.
Exempel:
En vanlig metod för att extrahera DNA från blod involverar:
1. lysis: Blodet blandas med en lysbuffert som innehåller tvättmedel och enzymer för att bryta upp cellerna och frisätta DNA.
2. Proteinborttagning: Proteinas K tillsätts för att smälta proteiner och separera DNA ytterligare.
3. centrifugering: Blandningen spinnas i en centrifug för att separera DNA från andra cellulära komponenter.
4. Etanolutfällning: Etanol tillsätts för att fälla ut DNA, som sedan uppsamlas genom centrifugering.
5. tvätt och lagring: DNA -pelleten tvättas för att avlägsna eventuella återstående föroreningar och lagras i en buffertlösning.
Denna förenklade översikt belyser de viktigaste stegen som är involverade i DNA -extraktion. Det finns variationer och optimeringar av dessa metoder beroende på de specifika experimentella kraven.
