Av Palmer Owyoung
Uppdaterad 30 augusti 2022

Jupiterimages/Photos.com/Getty Images

Den genetiska koden för en cell finns i dess DNA, som förblir låst i kärnan. För att studera genuttryck eller för att generera komplementära DNA-bibliotek (cDNA) måste DNA:t först transkriberas till budbärar-RNA (mRNA). Att isolera högkvalitativt mRNA är viktigt för att detektera sällsynta transkript, designa mikroarraysonder och konstruera cDNA-bibliotek.

Isolering av mRNA från totalt RNA

Steg 1 – TRIzol-homogenisering

Börja med att återsuspendera pelleterade celler i TRIzol Reagent (Life Technologies) eller en likvärdig fenol-guanidinlösning som Ambions TRI Reagent. Detta reagens lyser samtidigt celler, denaturerar proteiner och skyddar RNA från enzymatisk nedbrytning.

Steg 2 – Total RNA-isolering

Utför en serie centrifugeringar för att separera cellulära komponenter i distinkta faser. Kassera det gula, fettrika översta lagret. Samla upp den röda vattenfasen, som innehåller hela RNA-populationen (mRNA, tRNA, rRNA och icke-kodande RNA). Följ fenol-kloroformextraktionsprotokollet och tvätta sedan RNA-pelleten med isopropanol och etanol. Lägg till RNas-hämmare genomgående för att bevara RNA-integriteten.

Steg 3 – mRNA-extraktion

Kommersiella kit ger den mest reproducerbara mRNA-reningen. Populära val inkluderar Invitrogens FastTrack 2.0 och Ambions Poly(A)Pure mRNA Isolation Kit. Ett typiskt kit-protokoll fortsätter enligt följande:

• Kombinera upp till 300 µL totalt RNA med satsens RNase-hämmade lysbuffert.
• Värm vid 65 °C i 5 minuter och svalna sedan på is.
• Tillsätt 0,5 M NaCl och lös den medföljande oligo-dT (oligodeoxitymidylsyra) i blandningen.
• Centrifugera och återvinn supernatanten; binda mRNA till den medföljande kiseldioxidmatrisen.
• Tvätta upprepade gånger med lågsaltbindande buffert och sedan med tvättbuffert.
• Eluera mRNA till den specificerade volymen (vanligtvis ~500 µL).
• Fäll ut eluatet med natriumacetat och etanol och återsuspendera sedan i 10–20 µL DEPC-behandlat vatten.
• Förvara vid –80°C och bedöm koncentration och renhet med en UV-spektrofotometer.

Saker som behövs

• Laminärflödesskåp
• Personlig skyddsutrustning (labbrock, handskar, ögonskydd)
• Pipetter, spetsar, behållare för bortskaffande av biologiska faror
• Höghastighetscentrifug, värmeblock
• RNA-fria bänkytor
• RNAzap- eller RNAoff-reagenser
• Kommersiella mRNA-extraktionssatser (Invitrogen, Ambion, etc.)
• Natriumacetat, etanol, isopropanol
• DEPC-behandlat vatten
• UV-spektrofotometer och förbrukningsvaror
• Celler lämpliga för RNA-extraktion
• TRIzol eller TRI-reagens
• RNas-hämmare

TL;DR

Håll alla reagenser, celler och extraherat RNA kallt genom att placera dem på is. Kalla förhållanden hämmar RNas-aktivitet som frisätts under homogenisering.

Varning

TRIzol och liknande fenol-guanidinreagens är toxiska. Undvik kontakt med hud och slemhinnor och följ strikt institutionella säkerhetsprotokoll.

Referenser

• "cDNA Library Protocols"; Ian G. Cowell och Caroline A. Austin, 1997
• "In vitro-transkriptions- och översättningsprotokoll"; Martin J. Tymms, 1995