Av Sarah Quinlan
Uppdaterad 30 augusti 2022
Enligt University of Wisconsins BioWeb är en PCR-primer en kort, syntetisk oligonukleotid - vanligtvis 18 till 25 nukleotider lång - som används för att amplifiera specifika DNA-segment via polymeraskedjereaktion (PCR). Både framåt- och bakåtprimrar, utformade som omvända komplement, flankerar målregionen för att underlätta amplifiering. När forskare riktar in sig på en specifik gen eller DNA-region genererar PCR tillräckligt med material för nedströmsanalyser. Om lämpliga primers inte finns tillgängliga från publicerad litteratur eller kommersiella källor, blir det viktigt att designa anpassade primers.
Börja med att hämta nukleotidsekvensen för din målgen eller DNA-region och bestäm längden på fragmentet du vill amplifiera. Konventionell PCR amplifierar fragment mellan 100 och 1 000 baspar, medan realtids-PCR vanligtvis riktar sig till 50 till 200 baspar.
Bestäm var inom sekvensen dina primrar kommer att binda – nära 5′- eller 3′-änden, i mitten eller spänner över ett intron om så önskas.
Följ etablerade riktlinjer för primerdesign; framgången för amplifiering beror på primerkvalitet och nyckelparametrar.
Design primers 18–24 nukleotider långa. Dr. Vincent R. Prezioso, Ph.D., från Brinkmann Instruments rekommenderar detta intervall för optimal specificitet och effektiv glödgning. Mål en smälttemperatur (Tm) på 55–80°C, en GC-halt på 40–60 % och en GC-klämma i 3′-änden. Undvik tre eller fler G/C-baser i de senaste fem positionerna för att minska ospecifik bindning.
Undvik körningar av fyra eller fler identiska nukleotider eller dinukleotidupprepningar, eftersom dessa kan leda till felpriming. Se till att ingen intra-primer eller inter-primer komplementaritet som kan bilda självdimerer eller primer-dimerer.
Använd välrenommerade onlineverktyg – MIT:s Primer3 , NCBI:s Primer-Blast , och IDT:s OligoAnalyzer —för att utvärdera primeregenskaper och förutsäga sekundära strukturer.
