Thinkstock Images/Comstock/Getty Images
I början av gentekniken verkade idén att ympa egenskaper från en organism till en annan långsökt. Idag är dock att infoga främmande DNA i ett värdgenom en rutinprocess, oavsett om det är att lägga till skadedjursresistenta gener till majs, uttrycka humant insulin i bakterier eller modellera mänskliga cancerformer i möss. Även om de tekniska detaljerna kan vara invecklade, förblir den övergripande sekvensen av steg konsekvent och logisk.
Börja med att behandla plasmid-DNA och det främmande DNA-fragmentet med ett valt restriktionsenzym. Dessa enzymer känner igen specifika basmotiv och gör exakta snitt, vilket skapar kompatibla ändar för nedströms ligering. Restriktionsenzymer är naturligt härledda från bakteriella försvarssystem som klyver invaderande viralt DNA.
Blanda sedan den digererade plasmidryggraden med det kluvna främmande DNA:t och tillsätt DNA-ligas. De resulterande komplementära klibbiga ändarna härdar och ligas förseglar hacken och producerar cirkulära plasmider som bär det insatta DNA-segmentet.
Introducera de rekombinanta plasmiderna i kompetenta bakterieceller och låt dem återhämta sig. De kolonier som har tagit upp plasmiden kommer att växa på selektiva medier som innehåller lämpligt antibiotikum, tack vare resistensmarkören som kodas på plasmiden. Transformation kan uppnås via värmechock, elektroporering eller kemisk kompetens, beroende på bakteriestammen.
Skörda celler från individuella kolonier, lysera dem med en detergentbuffert för att frigöra plasmid-DNA och denaturera sedan strängarna genom värme- eller alkalibehandling. Detta förbereder DNA för nedströms screening.
Hybridisera det extraherade DNA:t med en fluorescensmärkt sond som är komplementär till den infogade sekvensen. Utsätt provet för UV-belysning; regioner med perfekt matchning kommer att avge fluorescens, vilket bekräftar närvaron av den främmande genen.
Välj kolonier som testade positivt för insättningen, expandera dem och isolera plasmid-DNA. Amplifiera plasmiden, om nödvändigt, med PCR för att generera tillräckligt med material för ytterligare analyser eller nedströmsapplikationer.
