yacobchuk/iStock/GettyImages

Översikt

Dubbelsträngat DNA är den genetiska ritningen i varje levande cell, men förfarandena för att isolera genomiskt DNA av hög kvalitet varierar markant mellan djur- och växtvävnader.

Allmänt extraktionsarbetsflöde

Celllys börjar med ett rengöringsmedel som stör lipidmembranen och frigör kromatin från kärn- och organellmembran. Blandningen behandlas sedan med alkohol för att fälla ut DNA. Även om de grundläggande stegen delas, beror effektiviteten och renheten hos slutprodukten på den specifika cellulära arkitekturen och förekomsten av föroreningar.

Distinkt cellstruktur

Växtceller har en stel cellvägg som består av cellulosa, hemicellulosa och pektin och innehåller kloroplaster som genererar en rad sekundära metaboliter. Många växtgenom är polyploida, vilket ökar både DNA-kvantitet och komplexitet. Djurceller saknar cellvägg och är beroende av rengöringsmedel som natriumdodecylsulfat (SDS) för att bryta plasmamembranet.

Utmaningar för utvinning av växt-DNA

Att bryta växtcellväggen är det första hindret. Mekanisk homogenisering eller enzymatisk nedbrytning med cellulas och pektinas tar bort barriären. Däremot kan polysackarider, fenolföreningar och tanniner fällas ut tillsammans med DNA, vilket minskar renheten. Noggranna tvättsteg och användningen av buffertar med hög salthalt hjälper till att lindra dessa föroreningar.

Djur-DNA-extraktion

Leukocyter från perifert blod är den vanligaste källan till genomiskt DNA från djur. Blod innehåller proteiner, lipider och cellrester som kan extraheras tillsammans med DNA. Den primära föroreningen är hem, den icke-proteinbaserade delen av hemoglobin, som stör enzymatiska reaktioner nedströms. Användning av en lysbuffert för röda blodkroppar följt av en reningskolonn eller fenol-kloroformextraktion tar bort hem och förbättrar utbytet.

Jämförande DNA-egenskaper

Växtgenom är ofta större och mer komplexa än djurgenom, delvis på grund av genduplicering och repetitiva element. Denna storleksskillnad påverkar mängden utgångsmaterial som krävs och extraktionsbuffertarnas kapacitet. Dessutom kan närvaron av sekundära metaboliter i växter förändra basparets sammansättning, vilket påverkar PCR-amplifiering och sekvenseringskvalitet.

Praktiska tips för högrent DNA

• Använd RNase för att eliminera RNA-kontamination.
• Inkludera ett proteassteg för att bryta ned kvarvarande proteiner.
• Applicera en silikabaserad kolonn eller magnetisk pärlorrening för konsekventa resultat.
• Kvantifiera DNA med en fluorometrisk analys för att undvika överskattning med spektrofotometri.

Genom att skräddarsy extraktionsprotokollet till den specifika celltypen kan forskare få tillförlitligt genomiskt DNA med hög renhet som är lämpligt för nedströmsapplikationer som sekvensering, PCR och kloning.