Molekylär diagnostik spelar en allt viktigare roll inom medicin för att upptäcka genetiska sjukdomar, övervakning av effektiviteten av anticancerterapi, och i kampen mot aggressiva bakterieinfektioner. Nyfikenhetsdiagnostik (CD), ett företag som tillhör Scope Fluidics-gruppen, har utvecklat en ny teknik för DNA-analys:synergistisk PCR (sPCR). Metoden, beskrivs i detalj i den gemensamma publikationen av CD- och IPC PAS-forskare i Vetenskapliga rapporter kombinerar fördelarna med två av dagens mest populära genetiska kodanalystekniker och kan utföras på allmänt tillgängliga instrument.

"Den DNA-analysteknik vi föreslår föddes under utvecklingen av det innovativa PCR|ONE-analysinstrumentet, som kan användas för att testa den genetiska koden på bara sju minuter. Detta är en mer än tio gånger kortare tid än vad som krävs i klassiska lösningar, säger Prof. Piotr Garstecki (IPC PAS, CD).

Prover som skickas för DNA-analyser innehåller vanligtvis så lite genetiskt material att analys av dem med konventionella laboratorietekniker inte skulle vara möjliga. Efter att ha eliminerat föroreningar från provet, det första steget är att öka mängden genetiskt material, ofta upp till en miljard gånger. polymeraskedjereaktion (PCR) används för detta ändamål.

PCR-reaktionen involverar cyklisk uppvärmning och kylning av en lösning som innehåller det genetiska materialet som amplifieras och lämpliga reagens:ett polymeras (dvs enzymet som katalyserar reaktionen av DNA-syntes), nukleotiderna som behövs för att bygga DNA-strängen, och primers, dvs. korta DNA-fragment som kan fästa till början och slutet av det förökade kodfragmentet (t.ex. en specifik gen). Varje PCR-cykel består av uppvärmnings- och kylningsfaser. I den första fasen, vid en temperatur på cirka 95 grader Celsius, vätebroarna går sönder, och den hittills dubbelsträngade DNA-kedjan delas upp i två enkla strängar. I den svala fasen, vid en temperatur på cirka 50 grader, primrarna från lösningen fäster på motsvarande platser på trådarna, varefter polymeraset bygger en komplementär tråd mellan dem. I slutet av varje cykel, det finns (under idealiska förhållanden) dubbelt så många dubbelsträngade DNA-fragment som i början.

PCR används för att detektera specifika fragment av den genetiska koden och för att uppskatta den ursprungliga mängden genetiskt material. Kvantitativa mätningar utförs vanligtvis med en analog teknik som kallas realtids-PCR. Provet förökas, och i efterföljande cykler, mängden DNA kontrolleras med fluorescerande färgämnen. När intensiteten av förändringarna överstiger en fastställd tröskel, den ursprungliga mängden genetiskt material uppskattas baserat på antalet cykler. Den analoga PCR-tekniken är relativt enkel, men på grund av PCR:s känslighet för enstaka partiklar av föroreningar, det kräver noggrannhet, kontinuerlig kalibrering.

En annan metod är digital PCR. Provet är indelat i tiotals eller hundratusentals, och ibland till och med miljontals partitioner med lika volymer. Sedan, i varje partition, förfarandet för duplicering av genetiskt material genomförs och kontroller görs om den inställda ändringen dyker upp. Under delning av provets DNA, molekyler når bara vissa partitioner, så förändringen sker inte överallt. Den ursprungliga mängden DNA kan därför uppskattas baserat på antalet registrerade signaler. Fördelen med digital teknik är att det inte finns något behov av att kalibrera enheten. Dock, på grund av behovet av att utföra ett stort antal reaktioner parallellt, testutrustningen är dyr och är inte lika vanlig i laboratorier som analoga PCR-apparater.

Synergistisk PCR, den teknik som föreslagits av CD och IPC PAS, kombinerar de viktigaste fördelarna med de analoga och digitala metoderna. För att få tillförlitliga mätningar, det räcker att späda ett prov till bara ett dussin, eller högst flera dussin partitioner. Denna metod kräver ingen kalibrering.

"Ett litet antal partitioner, kännetecknande för vår teknik, är av särskild praktisk betydelse. Det betyder att för att utföra analysen, allt som behövs är standardformatet för brunnsplattor som används i populära analoga PCR-enheter, säger Pawel Debski, en IPC PAS doktorand, som utvecklade sPCR-metoden på Curiosity Diagnostics.

På grund av ett litet antal provpartitioner, sPCR-tekniken är lättare att utföra och något snabbare än digitala varianter. Jämfört med analoga tekniker, dock, fler reagenser krävs. Av denna anledning, den kommer inte att ersätta den analoga varianten, enligt forskarna. Dock, det kan vara ett värdefullt tillägg eftersom det inte behöver någon kalibrering, vilket gör det möjligt för laboratoriepersonal att oberoende kontrollera korrektheten av analoga mätningar.

"Vår DNA-testteknik har patenterats. vi vill betona friheten att använda den för icke-kommersiella ändamål. Och eftersom den använder typiska, populär genetisk testutrustning, allt du behöver göra för att komma igång är att nå vår artikel, " framhåller prof. Garstecki.

I vanliga PCR-maskiner, relativt långsam värmediffusion mellan provet och ett intilliggande stort block av växelvis uppvärmt eller kylt material används för att värma och kyla det genetiska materialet. I PCR|ONE, infraröd strålning används för att snabbt värma provet. Diffusionskylmekanismen har också modifierats:blocket som används för detta ändamål är mindre än i konventionella instrument och det hålls på en konstant, strikt kontrollerad temperatur. Som ett resultat av de tekniska och analytiska förbättringarna, prototyperna av PCR|ONE kan slutföra DNA-analyser på mindre än en kvart, och själva PCR tar bara sju minuter. De första PCR|ONE-enheterna kommer troligen att komma ut på marknaden om två till tre år.