Andning i Actinomycetes och övergripande arkitektur för den mykobakteriella andningsmaskinen CIII2CIV2SOD2. A) Andningselektronöverföringskedjan i Actinomycetes (vänster) och de 5 stora prokaryota cytokrom c -vägvarianterna med organisationsscheman i representativa organismer (höger). M. smegmas cytokrom c-vägen har sin cytokrom c sammansmält med komplex III för att bilda ett komplex III av bcc-typ som interagerar med aa3-komplexet IV för att samlas i ett CIII-CIV-superkomplex. MK =menakinon/menakinol. B) Hela arkitekturen för bcc-aa3 typ respiratorisk CIII-CIV Superkomplex från M. smegmatis. Cryo-EM-kartan för superkomplexet visar en linjär 2-faldig dimeriserad form av CIV1-CIII2-CIV1 med måtten 200 x 70 x 120 Å. CIII syns i orange, CIV är magenta och associeringsfaktorerna PRSAF1 i grönt, LpqE i blått och SOD i grått. C) Tecknad bild av superkomplexets sidovy (uppifrån) och en tvärsnittsvy (nedtill). MK presenteras som ljusgröna fasta sfärer och fosfolipid som gula pinnar. I tvärsnittsvy längst ner, gränserna för CIII, CIV och associeringsfaktor PRSAF1 visas i streckade linjer i färg (orange för CIII, magenta för CIV och grönt för PRSAF1). Kreditera: Vetenskap , doi:10.1126/science.aat8923.
I en nyligen genomförd studie utförd av Hongri Gong och kollegor, ett respiratoriskt superkomplex isolerades från bakterien Mycobacterium smegmatis, och dess struktur visualiserades med en upplösning av 3,5 Å med användning av kryo-elektronmikroskopi (kryo-EM). Bakterien är en nära släkting till M. tuberculosis och en populär modell som används för att studera många andra bakteriearter. Den detaljerade strukturen avslöjade hur elektroner överfördes i cellen i en process som hittills inte setts.
Vanligtvis, kemisk energi för att syntetisera adenosintrifosfat (ATP) och kraftcellreaktioner extraheras under cellulär andning genom att koppla oxidationen av en energikälla (sockerarter, fettsyror och aminosyror) och minskning av en elektronacceptor (syre, svavel, nitrat och sulfat). Vid aerob cellandning, energi extraheras från elektrondonatorer till terminalacceptorn, syre, via elektrontransportkedjan (ETC) för att skapa en transmembran protongradient känd som en proton drivkraft (PMF) som driver ATP -syntes. De nya resultaten publiceras nu i Vetenskap avslöja en direkt länk för elektronöverföring mellan enzymer för att representera ett nytt sätt för respiratorisk kedjekatalys.
Kinoner och cytokromer är två typer av elektronbärare i ETC som används för att skicka elektroner till och från stora makromolekylära strukturer inbäddade i membranet. Fyra membranoxidoreduktaser är involverade i den mitokondriella andningskedjan för elektronöverföring. Dessa inkluderar komplex I (NADH:ubiquinon oxidoreduktas, CI), komplex II (succinat:ubiquinon oxidoreduktas, CII), komplex III (f 1 -typ ubiquinol:cytokrom c -oxidoreduktas, före Kristus 1 -typ CIII) och komplex IV (aa 3 -typ cytokrom c -oxidas, aa 3 -typ CIV). Efter funktion, CIII kan oxidera ubikinol till ubikinon och överföra elektronerna till lösligt cytokrom c. Elektroner skickas sedan till CIV, där syre reduceras till vatten. Transmembranen PMF genereras genom protonpumpning i CI, CIII och CIV.
Superkomplexets arkitektur i sin helhet:Den tecknade bilden visar menakinon/menakinol (MK) i ljusgröna fasta sfärer och fosfolipider som gula pinnar. Kreditera: Vetenskap , doi:10.1126/science.aat8923
I den prokaryota andningskedjan, situationen är mer komplicerad. En fullständig väg för elektronflöde har ännu inte fastställts i celltypen på grund av dess komplexitet. Det är därför nödvändigt att förstå hela strukturen för ett "superkomplex" som är involverat under bakteriell elektronöverföring för att hjälpa målet. I studien, forskarna extraherade och renade komplexet från M. smegmatis för att visualisera arkitekturen med hjälp av kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) med en upplösning på 3,5 Å. Strukturen gav avgörande insikter om mekanismen för direkt elektronöverföring inom ett andningssuperkomplex. Superkomplexets dimensioner låg i intervallet 200 x 70 x 120 Å, i en symmetriserad linjär arkitektur helt annorlunda än tidigare rapporterade respiratoriska superkomplex. Efter sammansättning, den linjära dimeriska CIV 1 -CIII 2 -CIV 1 arrangerades så att enskilda CIV flankerade den centrala CIII -dimern på vardera sidan. Informationen avslöjade en direkt koppling mellan enzymer under elektronöverföring, representerar ett nytt sätt för respiratorisk kedjekatalys. De detaljerade strukturfynden har potential att hjälpa till med antimykobakteriella läkemedelsupptäckande insatser.
Sammansättningen och strukturen för CIII -dimer. Menakinon/menakinol presenteras som ljusgröna fasta sfärer och fosfolipiderna är gula pinnar. Kreditera: Vetenskap , doi:10.1126/science.aat8923
Under experiment med bakterieceller, författarna använde en M. tuberculosis-liknande väteperoxidresistent M. smegmatis mutant stam. Cellerna odlades och membranet isolerades såsom beskrivits tidigare. Efter cellodling, skörd och celllys, cellmembranpellets skördades för att extrahera respiratoriska superkomplex. Superkomplexen karakteriserades med hjälp av optisk spektroskopi, masspektroskopi och 3, 3'-diaminobenzidin (DAB) färgning. För att identifiera hemgrupper, utvalda fraktioner analyserades genom inspelning av spektra före och efter reduktion med ditionat såsom beskrivits tidigare. De renade proverna analyserades med hjälp av nativ masspektroskopi för att undersöka arkitekturen och de enskilda strukturella komponenterna analyserades med hjälp av tidigare etablerade protokoll.
Under cryo-EM-analys, forskarna använde uranylacetat (1 procent vikt/volym) för negativ färgning, med användning av 5 µl av superkomplexprovet vid en koncentration av 0,05 mg/ml, bilder togs på ett FEI Tecnai Spirit -mikroskop med en effekt på 120 kV för den första modellbyggnaden. De förvärvade bilderna bearbetades med användning av en lågupplöst rekonstruktion av superkomplexet från 53 mikroskopier av det negativa färgade provet. För fullständig rekonstruktion av superkomplexet, författarna valde manuellt 7, 600 mikroskop från 8, 200 originalmikrobilder under cryo-EM-bildbehandling. Alla siffror i studien skapades med PyMOL- eller UCSF -chimär.
CIV:s sammansättning och struktur. Tecknad bild av komplexet IV. Fosfolipiderna visas som gula pinnar. Kreditera: Vetenskap , doi:10.1126/science.aat8923
Författarna avslöjade cryo-EM-strukturen för ett CIII-CIV andningssuperkomplex av M. smegmatis-bakterierna. Den intrakomplexa elektronöverföringsvägen sträckte sig från kinoloxidation i CIII till syrereduktion i CIV. Resultaten visade en ny mekanism för bifurcating elektronöverföring för att säkerställa fullbordandet av Q -cykeln (nettorörelsen av protoner över ett lipiddubbelskikt) för energitransduktion. Föreningen av ett superoxiddismutas i systemets arkitektur kan skydda mot oxidativ skada av reaktiva syrearter (ROS). Arkitekturen för kinonbindningsställen gav också en ram för framtida studier av strukturbaserade antimikrobiella läkemedelsfynd.
© 2018 Science X Network
