Ryska forskare från Prokhorov General Physics Institute vid Ryska vetenskapsakademin (GPI RAS) och Moskvas institut för fysik och teknologi (MIPT) har utvecklat världens första ultrakänsliga metod för snabb upptäckt av små molekyler. Denna metod upptäcker spårmängder av toxiner, hormoner, vitaminer och andra biologiskt aktiva molekyler som är betydelsefulla för hälso- och livsmedelssäkerhetsövervakning, bland andra möjliga tillämpningar. Studien publiceras i novembernumret av Analytica Chimica Acta .

Den nya sidoflödesanalysen bygger på magnetiska etiketter och tar mindre än 30 minuter. Det är 100 gånger känsligare än den enzymkopplade immunosorbentanalysen, eller ELISA, används för konventionella labbtester. Författarna visade effekten av den nya metoden på en modellanalys som mäter tyroxin i humant blodserum. Tyroxin är ett av nyckelhormonerna som produceras av sköldkörteln och är till hjälp för att övervaka dess funktion. Analysproceduren är överkomlig och enkel nog att utföras på vårdplatsen, direkt efter blodprovet.

Anledningen till att det är nödvändigt att upptäcka småmolekylära föreningar med hög känslighet är att de ofta har en stark effekt på kroppen även i små koncentrationer. För närvarande anses ELISA vara guldstandarden för att mäta koncentrationen av små molekyler. Dock, denna metod kräver adekvat utrustade labb med högt kvalificerad personal för dess implementering. Känsligheten för detektion av sköldkörtelhormon kan ökas via radioimmunoanalyser med radioaktiva märkningar som har korta halveringstider trots sina betydande begränsningar och som är potentiellt farliga. Andra konventionella analyser kräver lång provberedning och specialiserad utrustning.

Sidoflödesanalysen (LFA), allmänt känd för sin tillämpning i graviditetstester, representerar ett tilltalande alternativ. Jämfört med ELISA, det är mindre utarbetat och tekniskt komplicerat. Dock, i många länder, den har myndighetsgodkännande för att erhålla tröskelresultat endast och bara för de fall där hög känslighet inte är väsentligt. Det är därför ett främsta mål inom medicinsk diagnostik att utveckla en metod för upptäckt av små molekyler som skulle vara snabb, känslig, och enkelt.

I studien som rapporteras i denna berättelse, ett gemensamt forskarlag från GPI RAS och MIPT har utvecklat ett analyskit som använder en modifierad LFA med magnetiska nanoetiketter och bifunktionella ligander. För att testa det nya systemets kapacitet och begränsningar, författarna valde att detektera tyroxin, det huvudsakliga sköldkörtelhormonet, som modell. Dessutom gav det deras forskning klinisk betydelse.

Layouten för den nya magnetiska immunoanalysen skiljer sig från den konventionella LFA i flera avseenden (se figur 1). En patients blodserum, som testas för fritt tyroxin, kompletteras samtidigt med magnetiska nanopartikelmärkta antikroppar och med en bifunktionell tyroxinligand. Denna bifunktionella ligand är ett tyroxin som är kovalent bundet till biotin via en "brygga" som förbinder de två molekylerna men som också skiljer dem åt. Antikropparna på magnetiska nanopartiklar kan alltså binda både till tyroxin från blodserumet och till den bifunktionella liganden. Efter en viss tid, tillräckligt för att molekylerna i lösningen ska binda till varandra, blandningen avsätts på ett membran. Partiklar bundna till den bifunktionella liganden fångas på testlinjen av streptavidin, ett protein som har en utomordentligt hög affinitet för biotin. För att hämta analysresultaten, forskarna använde original elektronisk utrustning, som använder den ultrakänsliga magnetiska partikelkvantifieringsmetoden, eller MPQ. Det involverar ickelinjär partikelommagnetisering genom ett alternerande magnetfält vid två frekvenser och en efterföljande detektering av det induktiva svaret vid kombinatoriska frekvenser. Tillsammans med noggrannheten hos MPQ-metoden, den höga affiniteten hos den bifunktionella liganden mot testremsan säkerställer en oöverträffad känslighet hos analysen som når en detektionsgräns på cirka 1 miljon molekyler av hormonet per milliliter (16 femtogram!) med ett dynamiskt område på tre ordningsföljder.

Petr Nikitin, Ph.D., som ledde forskargruppen, delade mer detaljer om studien:"Våra metoder för att mäta koncentrationen av små molekylföreningar utförs via universella immunokromatografiska remsor med streptavidin på detektionslinjen. Så, de är lätta att replikera och skala upp. För att utveckla tester för andra analyter skulle vi kräva standardantikroppar och speciella bifunktionella ligander, vars syntes för små molekyler är utmanande."

"Lyckligtvis, vår verktygslåda innehåller original interferometrisk teknik och utrustning som vi utvecklat tidigare, som möjliggör realtidsdetektering av molekylär interaktionsdynamik, " förklarade Petr Nikitin, en MIPT-examen 1979 och chef för ett laboratorium vid GPI RAS. "Vi använde den här utrustningen för att identifiera de optimala immunreaktanterna och de bifunktionella tyroxin-biotinliganderna, som till sin natur är fördelade, "överbryggad" struktur gör båda små molekylerna tillgängliga för effektiv interaktion med båda stora molekylerna - nämligen, med den detekterande antikroppen och streptavidin. Det sparade oss mycket tid för testutveckling och bidrog till stor del till framgången för denna forskning."

Tidningens huvudförfattare, Alexey Orlov, Ph.D., en forskare vid GPI RAS och MIPTs Nanobiotechnology Lab, tillade:"Vi använder magnetiska partiklar som nanoetiketter för immunkemiska reaktioner. En bärbar enhet detekterar dessa partiklar kvantitativt med rekordhög precision från hela volymen av 3D-reaktionszonen på en testremsa, snarare än från ytan av ett membran, som det händer i fallet med optiska etiketter. Detta är en av faktorerna som säkerställer enkelheten i våra ultralåga koncentrationsmätningar av små molekyler i komplexa medier. Som ett resultat, praktiskt taget alla är utrustade för att utföra unikt känsliga analyser utan komplicerade provförberedelser."

"Den nya analysen är en punkt-of-care testteknik vars egenskaper avsevärt överträffar de befintliga systemen för laboratoriediagnostik, sa Sergey Znoyko, Ph.D., tidningens första författare. "I framtiden, genom att utöka utbudet av biologiska molekyler som kan detekteras på detta sätt, vi skulle kunna utföra en multiparameteranalys av komplexa medier som blod som skulle vara mycket billigare än dess nuvarande analoger."

"Det här tillvägagångssättet är enkelt, prisvärd, och anpassningsbar för detektion av andra små molekyler, " sa MIPT doktorand Natalia Guteneva, som var medförfattare till studien. "Vi hoppas att det skulle användas aktivt för att söka efter nya sjukdomsmarkörer, inom medicinsk diagnostik, ekologisk övervakning, livsmedelssäkerhetskontroll, biosäkerhet, och på andra håll."