Rice University syntetiska biologer har hackat bakteriell avkänning med ett plug-and-play-system som kan användas för att blanda och matcha tiotusentals sensoriska input och genetiska utdata. Tekniken har omfattande implikationer för medicinsk diagnostik, studien av dödliga patogener, miljöövervakning med mera.

I ett projekt som sträcker sig över nästan sex år, Rice bioingenjör Jeff Tabor och kollegor genomförde tusentals experiment för att visa att de systematiskt kunde koppla om tvåkomponentsystem, de genetiska kretsar som bakterier använder för att känna av sin omgivning och lyssna på sina grannar. Deras arbete visas i en studie som publicerades denna vecka i Naturens kemiska biologi .

Tabors grupp kopplade om utgångarna från kända bakteriesensorer och flyttade även sensorer mellan avlägset besläktade bakterier. Viktigast, de visade att de kunde identifiera funktionen hos en okänd sensor.

"Baserat på genomiska analyser, vi vet att det finns minst 25, 000 tvåkomponentsystem i bakterier, sa Tabor, docent i bioteknik vid Rice's Brown School of Engineering och den ledande forskaren i projektet. "Dock, för cirka 99 % av dem, vi har ingen aning om vad de känner eller vilka gener de aktiverar som svar."

Vikten av ett nytt verktyg som låser upp tvåkomponentsystem understryks av upptäckten 2018 av två stammar av en dödlig, multiresistent bakterie som använder ett okänt tvåkomponentsystem för att undvika kolistin, ett antibiotikum i sista hand. Men Tabor sa att de möjliga användningarna av verktyget sträcker sig bortom medicin.

"Detta är naturens största skattkammare av biosensorer, ", sa han. "Baserat på den utsökta specificiteten och känsligheten hos några av de tvåkomponentsystem vi förstår, Det är allmänt trott att bakteriesensorer kommer att överträffa allt människor kan göra med dagens bästa teknologi."

Tabor sa att det beror på att bakteriesensorer har finslipats och förfinats genom miljarder år av evolution.

"Bakterier har inte något så sofistikerat som ögon, öron eller näsa, men de reser mellan väldigt olika miljöer – som ett löv eller en tarm eller jorden – och deras överlevnad beror på deras förmåga att känna av och anpassa sig till dessa förändringar, " han sa.

"Tvåkomponentsystem är hur de gör det, " Sa Tabor. "Det här är systemen de använder för att "se" ljus, "dofta" på kemikalierna runt dem och "hör" de senaste communitynyheterna, som kommer i form av biokemiska tweets som sänds av sina grannar."

Bakterier är den vanligaste formen av liv, och tvåkomponentsystem har visat sig i praktiskt taget varje bakteriegenom som har sekvenserats. De flesta arter har cirka två dussin av sensorerna och vissa har flera hundra.

Det finns mer än ett halvdussin breda kategorier av tvåkomponentsystem, men alla fungerar på ett liknande sätt. De har en sensorkinas (SK) komponent som "lyssnar" efter en signal från omvärlden, och när jag "hörde" det, initierar en process som kallas fosforylering. Det aktiverar den andra komponenten, en responsregulator (RR) som verkar på en specifik gen – slår på eller av den som en strömbrytare eller upp eller ner som en ratt.

Medan den genetiska koden för komponenterna lätt kan upptäckas på en genomisk skanning, det dubbla mysteriet gör det nästan omöjligt för biologer att avgöra vad ett tvåkomponentsystem gör.

"Om du inte känner till signalen som den känner av och du inte känner till genen som den verkar på, det är riktigt svårt, ", sa Tabor. "Vi vet antingen ingången eller utsignalen från cirka 1 % av tvåkomponentsystem, och vi känner både ingångar och utgångar för färre fortfarande."

Forskare vet att SK vanligtvis är transmembranproteiner, med en avkänningsdomän, en slags biokemisk antenn, som sticker igenom bakteriens säckliknande yttre membran. Varje sensordomän är utformad för att låsa fast vid en specifik signalmolekyl, eller ligand. Varje SK har sin egen målligand, och bindning med liganden är det som startar kedjereaktionen som sätter på en gen, av, upp eller ner.

Viktigt, även om varje tvåkomponentsystem är optimerat för en specifik ligand, deras SK- och RR-komponenter fungerar på liknande sätt. Med det i åtanke, Tabor och studiens huvudförfattare Sebastian Schmidl bestämde sig i slutet av 2013 för att försöka byta ut den DNA-bindande domänen, den del av responsregulatorn som känner igen DNA och aktiverar vägens målgen.

"Om man tittar på tidigare strukturella studier, den DNA-bindande domänen ser ofta ut som last som bara är på väg från fosforyleringsdomänen, " sade Tabor. "På grund av det, vi trodde att DNA-bindande domäner kunde fungera som utbytbara moduler, eller legoklossar."

För att testa idén, Schmidl, sedan en DFG-postdoktor i Tabors grupp, kopplade om komponenterna i två ljussensorer som Tabors team tidigare hade utvecklat, en som svarade på rött ljus och en annan som svarade på grönt. Schmidl kopplade om ingången från rödljussensorn till utgången från grönljussensorn på 39 olika platser mellan fosforylerings- och DNA-bindande domäner. För att se om någon av de 39 skarvarna fungerade, han stimulerade dem med rött ljus och letade efter ett grönt ljussvar.

"Tio av dem arbetade på första försöket, och det fanns ett optimum, en specifik plats där skarven verkligen verkade fungera bra, " sa Tabor.

Faktiskt, testet fungerade så bra att han och Schmidl trodde att de helt enkelt kunde ha haft tur och skarvat ihop två ovanligt väl matchade vägar. Så de upprepade testet, först fästa fyra ytterligare DNA-bindande domäner till samma svarsregulator och senare fästa fem DNA-bindande domäner till samma sensorväg. De flesta av dessa omledningar fungerade också, vilket indikerar att tillvägagångssättet var mycket mer modulärt än något tidigare publicerat tillvägagångssätt.

Schmidl, nu biträdande professor i biologi vid Texas A&M University Systems RELLIS campus i Bryan, lämnade Rice 2016. Medförfattare Felix Ekness, en Ph.D. student i Rice's Systems, Syntetisk och fysisk biologi (SSPB) program, tog sedan upp projektet, konstruera dussintals nya chimärer och genomföra hundratals fler experiment för att visa att metoden kan användas för att blanda och matcha DNA-bindande domäner mellan olika arter av bakterier och mellan olika familjer av tvåkomponentsystem.

Tabor visste att en topptidning skulle kräva en demonstration av hur tekniken kunde användas, och att upptäcka funktionen hos ett helt nytt tvåkomponentsystem var det ultimata testet. För detta, postdoktor Kristina Daeffler och SSPB Ph.D. studenten Kathryn Brink transplanterade sju olika okända tvåkomponentsystem från bakterien Shewanella oneidensis till E. coli. De konstruerade en ny E. coli-stam för varje okänd sensor, och använde DNA-bindande domänbyte för att koppla alla deras aktiviteter till uttrycket av grönt fluorescerande protein.

Även om de inte kände till input för någon av de sju, de visste att S. oneidensis upptäcktes i en sjö i delstaten New York. Baserat på det, de valde 117 olika kemikalier som S. oneidensis kan ha nytta av att känna av. Eftersom varje kemikalie måste testas en-mot-en med varje mutant och en kontrollgrupp, Brink var tvungen att utföra och replikera nästan 1, 000 separata experiment. Ansträngningen gav resultat när hon upptäckte att en av sensorerna detekterade förändringar i pH.

En genomisk sökning efter den nyligen identifierade sensorn underströk vikten av att ha ett verktyg för att låsa upp tvåkomponentsystem:pH-sensorn dök upp i flera bakterier, inklusive patogenen som orsakar böldpest.

"Detta belyser hur upplåsning av mekanismen för tvåkomponentsystem kan hjälpa oss att bättre förstå och förhoppningsvis bättre behandla sjukdomar också, " sa Tabor.

Vart tar Tabor tekniken härnäst?

Han använder det för att bryta genomet från mänskliga tarmbakterier för nya sensorer för sjukdomar inklusive inflammatorisk tarmsjukdom och cancer, med målet att konstruera en ny generation smarta probiotika som kan diagnostisera och behandla dessa sjukdomar.