Förmågan att odla stora proteinkristaller är den enskilt största flaskhalsen som begränsar användningen av neutronproteinkristallografi i strukturbiologi. Proteinkristaller måste ha volymer i området minst 0,1 mm ³ . Teoretiskt sett finns det ingen speciell anledning till varför kristaller av denna storlek inte kan odlas. Om de kan vara, neutronproteinkristallografi kan ge viktig information om var väteatomerna befinner sig detaljer relaterade till hydreringsvätebindning och ligandinteraktioner. Denna typ av information är av direkt relevans för akademisk och farmakologiskt driven forskning inom biovetenskap.

Utmaningen är alltså att uppnå stor kristalltillväxt i en reproducerbar, tids sparande, arbetsbesparande sätt. Det skulle vara idealiskt om i framtiden, neutronkristallografer kan, efter lämpligt förkarakteriseringsarbete, skicka in sina lösningar till en automatiserad eller halvautomatiserad plattform som skulle möjliggöra utforskning av ett stort antal förhållanden på ett mycket systematiskt sätt och för att tillåta användare att övervaka tillväxten från sina fjärrdatorer.

Ashley Jordan vid Institut Laue-Langevin (ILL) i Grenoble, Frankrike, har undersökt två nya metoder för kristalltillväxt:utvecklingen av en modul som skulle kunna möjliggöra större automatiserade tillvägagångssätt i framtiden (uppgift 1), och ett flödeskristallisationssystem (uppgift 2).

Uppgift 1:En modul för automatiserad utforskning av stor kristalltillväxt

Detta SINE2020-projekt har fokuserat på utvecklingen av en temperaturkontrollerbar multibrunnsmodul där kristalltillväxt kan optimeras. Tanken med att designa denna modul var att skala upp metoden så att flera kristallisationsbrunnar med individuell (programmerbar) temperaturkontroll kunde användas för att utforska ett brett spektrum av tillväxtförhållanden. En prototypmodul gjordes som bestod av en anpassad plattdesign innehållande 6 × 4 brunnar där de individuella kristallisationsexperimenten kan ske. Varje brunn kan anpassas till olika förhållanden, var och en har oberoende temperaturkontroll. Brunnarna värms upp med Peltier-värmeelement med ett temperaturåterkopplingssystem som gör att varje brunn kan värmas och kylas över ett temperaturområde på 4 grader C till 60 grader C, med en noggrannhet på 0,1 grad. Uppställningen utformades för att tillåta kristalltillväxt att övervakas och registreras fotografiskt.

Ashley Jordan, Ryo Mizuta och John Allibon (som utvecklade mjukvaran) har byggt och testat prototypsystemet. Kristallisationstester har utförts med trypsin och rubredoxin.

Post-SINE2020, Tanken skulle vara att göra dessa moduler "plug and play" så att en mer utökad "robotisk" metod kan användas. Kristallogeneskörningar kan tas bort av användaren när de är klara och andra körningar installeras med en annan modul – modulen skulle vara arbetsenheten i en större array – där alla kan visualiseras av kameran och tillhandahålla time-lapse-information till en användarportal.

Uppgift 2:Flödeskristallisation

Ett annat sätt att driva stor kristalltillväxt är idén om ett flödeskristallisationssystem. Tanken är att upprätthålla stabila batchförhållanden runt en kristall hela tiden under dess tillväxt, genom att tillhandahålla en konstant tillförsel av färskt proteinstam till kristallisationsmiljön. Detta kommer att upprätthålla optimala lösningsförhållanden hela tiden och hjälpa till att minimera ackumulering av föroreningar på kristallytor – sådana föroreningar kan hindra kristalltillväxt.

En Dolomite Mitos P-Pump valdes för att bibehålla den extremt låga flödeshastigheten (mellan 70-1500 nl min-1) som krävs för att reglera systemet. En lämplig kristallisationskammare som kan anslutas till pumpen designades och tillverkades med en 3D-skrivare. Denna kammare skapar en förseglad miljö och ger enkel tillgång till kristallerna när de har växt.