Forskare vid Fred Hutchinson Cancer Research Center tog ett steg mot att göra genterapi mer praktisk genom att förenkla hur instruktioner för genredigering levereras till celler. Att använda en guldnanopartikel istället för ett inaktiverat virus, de levererade säkert genredigeringsverktyg i labbmodeller av HIV och ärftliga blodsjukdomar, som rapporterats 27 maj in Naturmaterial .

Det är första gången som en guldnanopartikel laddad med CRISPR har använts för att redigera gener i en sällsynt men kraftfull undergrupp av blodstamceller, källan till alla blodkroppar. Den CRISPR-bärande guldnanopartikeln ledde till framgångsrik genredigering i blodstamceller utan toxiska effekter.

"När genterapier tar sig igenom kliniska prövningar och blir tillgängliga för patienter, vi behöver ett mer praktiskt tillvägagångssätt, " sa seniorförfattaren Dr Jennifer Adair, en assisterande medlem av Clinical Research Division på Fred Hutch, och tillägger att nuvarande metoder för att utföra genterapi är otillgängliga för miljontals människor runt om i världen. "Jag ville hitta något enklare, något som passivt skulle leverera genredigering till blodstamceller."

Medan CRISPR har gjort det snabbare och enklare att exakt leverera genetiska modifieringar till genomet, det har fortfarande utmaningar. Att få celler att acceptera CRISPR-genredigeringsverktyg innebär en liten elektrisk stöt som kan skada och till och med döda cellerna. Och om exakta genredigeringar krävs, sedan måste ytterligare molekyler konstrueras för att leverera dem – vilket ökar kostnaden och tiden.

Guldnanopartiklar är ett lovande alternativ eftersom ytan på dessa små sfärer (cirka 1 miljarddel av storleken på ett korn bordssalt) gör att andra molekyler lätt kan fästa vid dem och hålla sig vidhäftade.

"Vi konstruerade guldnanopartiklarna för att snabbt korsa cellmembranet, undvika cellorganeller som försöker förstöra dem och gå direkt till cellkärnan för att redigera gener, " sa Dr. Reza Shahbazi, en Fred Hutch-postdoktor som har arbetat med guldnanopartiklar för läkemedels- och genleverans i sju år.

Shahbazi tillverkade guldpartiklarna från laboratorieklassat guld som renas och kommer som en vätska i en liten labbflaska. Han blandade det renade guldet till en lösning som får de enskilda guldjonerna att bilda små partiklar, som forskarna sedan mätte för storlek. De fann att en viss storlek - 19 nanometer bred - var den bästa för att vara stor och klibbig nog att lägga till genredigerande material till partiklarnas yta, samtidigt som de fortfarande är tillräckligt små för att cellerna ska kunna absorbera dem.

Packad på guldpartiklarna, Fred Hutch-teamet lade till dessa genredigeringskomponenter (diagram tillgängligt):

• En typ av molekylär guide som kallas crRNA fungerar som en genetisk GPS för att visa CRISPR-komplexet var i genomet det ska skäras.
• CRISPR nukleasprotein, ofta kallad "genetisk sax, " gör snittet i DNA:t. Det CRISPR-nukleasprotein som oftast används är Cas9. Men Fred Hutch-forskarna studerade också Cas12a (tidigare kallad Cpf1) eftersom Cas12a gör ett förskjutet snitt i DNA. Forskarna hoppades att detta skulle göra det möjligt för cellerna att mer effektivt reparera snittet och samtidigt bädda in de nya genetiska instruktionerna i cellen. En annan fördel med Cas12a framför Cas9 är att den bara kräver en molekylär guide, vilket är viktigt på grund av utrymmesbegränsningar på nanopartiklarna. Cas9 kräver två molekylära guider.
• Instruktioner för vilka genetiska förändringar som ska göras ("ssDNA"). Fred Hutch-teamet valde två ärftliga genetiska förändringar som ger skydd mot sjukdomar:CCR5, som skyddar mot HIV, och gammahemoglobin, som skyddar mot blodsjukdomar som sicklecellssjukdom och talassemi.
• En beläggning av en polyetylenimin svärmar ytan på partiklarna för att ge dem en mer positiv laddning, vilket gör att de lättare kan absorberas i cellerna. Detta är en förbättring jämfört med en annan metod för att få celler att ta upp genredigeringsverktyg, kallas elektroporation, vilket innebär att man lätt chockerar cellerna för att få dem att öppna sig och låta de genetiska instruktionerna komma in.

Sedan isolerade forskarna blodstamceller med en proteinmarkör på ytan som heter CD34. Dessa CD34-positiva celler innehåller de blodbildande progenitorcellerna som ger upphov till hela blodet och immunsystemet.

"Dessa celler fyller på blod i kroppen varje dag, vilket gör dem till en bra kandidat för engångsgenterapi eftersom det kommer att hålla en livstid när cellerna ersätter sig själva, sa Adair.

Att observera mänskliga blodstamceller i en labbskål, forskarna fann att deras fullastad guldnanopartiklar togs upp naturligt av celler inom sex timmar efter att de lades till och inom 24 till 48 timmar kunde de se genredigering ske. De observerade att Cas12a CRISPR-proteinpartnern var bättre på att leverera mycket exakta genetiska redigeringar till cellerna än den mer vanliga cas9-proteinpartnern.

Genredigeringseffekten nådde en topp åtta veckor efter att forskarna injicerade cellerna i musmodeller; 22 veckor efter injektionen var de redigerade cellerna fortfarande kvar. Fred Hutch-forskarna hittade också redigerade celler i benmärgen, mjälte och tymus från musmodellerna, ett tecken på att de delande blodkropparna i de organen kunde fortsätta behandlingen utan att mössen behöver behandlas igen.

"Vi tror att vi har en bra kandidat för två sjukdomar - HIV och hemoglobinopatier - även om vi också utvärderar andra sjukdomsmål där små genetiska förändringar kan ha stor inverkan, samt sätt att göra större genetiska förändringar, ", sa Adair. "Nästa steg är att öka hur mycket genredigering som sker i varje cell, vilket definitivt är genomförbart. Det kommer att göra det närmare en effektiv terapi."

I studien, forskarna rapporterar att 10 till 20 procent av cellerna tog på sig genredigeringarna, vilket är en lovande start, men forskarna skulle vilja sträva efter att 50 % eller mer av cellerna redigeras, som de tror kommer att ha goda möjligheter att bekämpa dessa sjukdomar.