I ett steg mot att öka kostnadseffektiviteten för förnybara biobränslen och bioprodukter, forskare vid Oak Ridge National Laboratory upptäckte ett mikrobiellt enzym som bryter ned bindningar som är svåra att bryta i lignin, en restprodukt från bioraffinaderier.

När den sätts in i en biokonstruerad bakterie, enzymet hjälper till att effektivt omvandla ligninföreningar till en vanlig komponent i plast, öppna en väg för att omvandla avfall till en kommersiellt värdefull biokemikalie.

"Lignin är en riktigt komplicerad polymer, " sa Josh Michener, som ledde ORNL:s forskning enligt detaljer i Metabolisk teknik . Polymeren, som bidrar till växternas strukturella styvhet, består av användbara monomerenheter som hålls samman av svaga och starka bindningar. Med lignin som utgör 20 % till 30 % av växtbiomassan i vikt, att bryta polymerens starka bindningar och omvandla de kemikalier de länkar samman till förädlade produkter är nödvändigt för att göra produktionen av växtbaserade biobränslen och produkter ekonomiskt lönsam.

Olika samhällen av bakterier och svampar utför dessa processer i naturen, men att upprätthålla en blandning av så många olika mikrober i en bioreaktor kan vara knepigt. För att lösa det här problemet, ORNL-forskare vid Center for Bioenergy Innovation, eller CBI, vill identifiera de enzymer som mikrober använder för att bryta ned specifika bindningar i lignin och konstruera generna som kodar för dessa enzymer till en enda organism.

Arbetar mot detta mål, ORNL-forskare riktade in sig på en särskilt envis bindning som länkar två kolmolekyler i en lignin-dimer - en enhet av två förenade monomerer - kallad 1, 2-diguaiacylpropan-1, 3-diol, eller DGPD.

Teamet använde bakterien Novosphingobium aromaticivorans, en mikrob av intresse för ligninvalorisering. Efter att ha identifierat och odlat en mutant N. aromaticivorans-stam som effektivt degraderade den önskade kopplingen i DGPD, forskarna använde bakteriell genetik och genstörningstekniker för att hitta vilket enzym som var ansvarigt.

Till deras förvåning, enzymet de identifierade – som de kallade LsdE – hade märkts som ett hypotetiskt protein, vilket betyder att dess funktion var okänd.

"Ingen hade sett den här typen av kemi tidigare, ", sa Michener. "Det fanns inga exempel i litteraturen på ett enda enzym som kunde göra just denna transformation."

Upptäckten möjliggjordes av ORNL-teamets genom-skala tillvägagångssätt. Biologiska tekniker bygger ofta på homologi, en metod för att undersöka enzymer som liknar de med kända funktioner. Dock, Michener noterade, "När vi letar efter ett hypotetiskt protein som aldrig har beskrivits, vi kan inte hitta det genom homologi."

Istället, teamet använde genetiska tekniker som gjorde det möjligt för dem att hitta leads genom att titta brett över N. aromaticivorans genom. De konstruerade sedan en uppsättning muterade mikrober, var och en med en enda gen störd. Kollektivt, varje icke-essentiell gen stördes i åtminstone en av dessa mutanter.

Om den muterade mikroben förlorade sin förmåga att bryta ner DGPD-dimeren när en viss gen togs bort, forskarna kunde fastställa att enzymet som kodas av den genen var ansvarigt för nedbrytningen, utan att behöva känna till dess funktion i förväg.

"I detta fall, Det fanns ingen anledning till att vi någonsin skulle titta på LsdE och säga att det här enzymet uppenbarligen gör den reaktionen, " sa Michener. "Det var en av de mest spännande delarna - och det faktum att vi har metoder på plats för att göra den typen av upptäckter."

I en annan mikrob, nya möjligheter

Efter att ha identifierat LsdE, ORNL-teamet testade för att se om de kunde validera dess funktion ytterligare. Deras test bekräftade rollen av LsdE och avslöjade att ett mer känt enzym, LsdA, spelat en kompletterande roll för att ytterligare bryta ner DGPD till användbara föreningar.

Vid National Renewable Energy Laboratory, en projektpartner i CBI, forskare infogade båda enzymerna i en stam av bakterien Pseudomonas putida som redan hade konstruerats för att producera mukonsyra, en mervärdesprekursor för plast. De fann att tillsatsen av enzymerna gjorde det möjligt för P. putida att omvandla DGPD till mukonsyra med nästan 100 % utbyte.

"Med många produkter, du tappar kol på vägen, sa Allison Werner, en postdoktor vid NREL och medförfattare till studien. "Men i det här fallet, vi har en mycket effektiv väg."

"Till det bästa av vår analytiska förmåga, varje molekyl av dimeren som vi började med omvandlades till två molekyler av produkten, vilket är ganska fenomenalt, " sa Michener.

Detta arbete är en del av en större satsning på att omvandla lignin till förädlade produkter. Framtida forskning kommer att syfta till att upptäcka nya enzymer som bryter ner andra tuffa kopplingar och att bättre förstå den kemiska strukturen hos LsdE.