Kredit:Unsplash/CC0 Public Domain
Hur kommer en näsa ihåg att det är en näsa? Eller kommer ett öga ihåg att det är ett öga?
När forskare undersöker frågan om hur celler kommer ihåg vilken typ av celler de ska vara, eller deras genetiska härstamning, är det viktigt att förstå hur celler uttrycker olika gener utan att ändra själva DNA-sekvensen.
Men att studera detta ämne är svårt:Forskare kan rena proteinerna som driver genetiskt uttryck, lägga dem i ett provrör och se dem binda. Men att göra det inuti cellkärnan, deras inhemska miljö, har hittills varit omöjligt.
Nu har ett team av forskare vid tre laboratorier vid University of Michigan kunnat spåra hur ett protein binder till sitt kromatinsubstrat i en levande cell genom att etablera ett samarbete som kombinerar toppmodern ultrahögupplöst bildbehandling, syntetiskt protein design och beräkningsmodellering. Deras resultat publiceras i Science Advances .
"Den biologiska frågan som vi ställer är:"Hur minns celler faktiskt tidigare erfarenheter? Och hur leder dessa upplevelser också till att celler etablerar distinkta identiteter, som det händer i fallet med människokroppen där du har celllinjer som bildar neuroner, eller blodceller, eller hjärnceller, och alla behåller faktiskt sin identitet i många generationer, säger huvudförfattaren Kaushik Ragunathan, biträdande professor i biologisk kemi vid UM Medical School.
"Ett exempel jag gärna tänker på är att om du hugger av näsan så får du ingen hand att växa där, även om arvsmassan i näsan och arvsmassan i handen är exakt likadan."
Celler styr hur och vilka gener som uttrycks från en kopia av DNA-sekvensen som finns i varje cell, trots att sekvensen är densamma i alla celler i kroppen. Ett sätt de kontrollerar uttrycket är genom att ändra hur tätt DNA:t är förpackat i kärnan med hjälp av proteiner som kallas "histoner". Histoner kan modifieras genom tillsats av små kemiska taggar som reglerar hur hårt DNA:t lindas runt dem och därmed om generna kan uttryckas.
Proteiner som har förmågan att läsa, skriva och radera dessa histontaggar utforskar DNA i cellens kärna mycket snabbt - i storleksordningen millisekunder, enligt Ragunathan. I slutändan måste all denna epigenetiska information ärvas över generationer, men igenkännandet av dessa taggar är en komplicerad process som involverar kromatinbindning och proteiner som möter och interagerar med varandra mitt i kaoset av alla andra möjliga konkurrerande interaktioner inom cellen.
Att kunna förstå varje steg i processen – och därmed möjliggöra kontroll över hur den epigenetiska informationen ärvs – fascinerade medförfattaren Julie Biteen, professor i kemi och biofysik.
Biteen använder enkelmolekylär fluorescensavbildning för att spåra individuella proteiner inuti celler. Hennes labb kan se var dessa proteiner är i förhållande till kromatinet, och Ragunathans expertis ligger i de molekylära mekanismerna som ligger till grund för hur histonmodifieringar och histonbindande proteiner interagerar. Dessa två världar behövde mötas så att biokemin av vad som händer i ett provrör utanför cellerna kunde testas för att ta reda på vad som händer inuti dem.
"Timingen av denna process är avgörande för att säkerställa att rätt gener tystas på rätt plats och vid rätt tidpunkt," sa Biteen. "Det som fastnade för det här projektet är att du in vitro – i ett provrör – kan rena två proteiner, se dem binda och se hur bra den bindningen är, eller vad är affiniteten för varandra. Det berättar vad som kan hända i cellerna, men inte vad som händer i cellerna."
Biteen och Ragunathan arbetade med Peter Freddolino, docent i biologisk kemi, och beräkningsmedicin och bioinformatik vid UM Medical School, för att kombinera datormodellering med deras experimentella resultat.
"Det är verkligen här vårt samarbete blir riktigt kraftfullt," sa Biteen. "Å ena sidan är det mycket användbart att se molekyler och att veta hur snabbt molekylerna rör sig hjälper mycket när det gäller att förstå vad som är möjligt inuti cellen, men här skulle vi kunna ta ett steg framåt genom att störa systemet även på onaturliga sätt för att förstå vad dessa olika rörelser av molekyler i cellen faktiskt betyder."
Medan epigenetiska märken är oerhört viktiga för att upprätthålla olika vävnader i komplexa organismer som människor, spelar de också en viktig roll för att reglera gener hos encelliga organismer som jäst. Teamet fokuserade på en typ av HP1-protein i jästceller som kallas Swi6. Denna familj av proteiner binder till en specifik typ av histonmodifieringar i cellen för att framtvinga gentystnad. Genom att integrera fluorescerande etiketter med Swi6 såg Bitees labb Swi6 röra sig inuti cellens kärna.
Medan Swi6 söker efter det korrekta bindningsstället på DNA, rör det sig snabbt, sa Biteen. När den hittar sitt mål saktar den ner betydligt. Rörelsen av ett protein i cellen liknar växlar i en bil och saker kan röra sig i olika hastigheter beroende på vem proteiner interagerar med.
"Från dessa spagettispår som vi får in i cellen, räknar vi sedan ut hur mycket tid de spenderar på att söka och hur mycket av tiden de spenderar bunden," sa Biteen. "Mängden tid de spenderar på att inte röra sig säger oss om hur starkt de interagerar och deras biokemiska egenskaper."
Medan Biteens labb kan mäta rörelser i cellen på en skala av tiotals millisekunder, sker mycket av biokemin som sker i cellen ännu snabbare, sa hon. Freddolino tog denna experimentella information och utvecklade modeller för att uppskatta förmågan hos Swi6-proteinerna att hoppa mellan de bindande tillstånden som identifierades i experiment.
Freddolinos modellering tog hänsyn till de experimentella mätningarna och de möjliga biokemiska egenskaperna, vilket inkluderar hur Swi6-molekylerna interagerar i cellen. Dessa interaktioner inkluderar molekyler som fritt flyter i cellens lösning, molekyler som har bundit till DNA och molekyler som "håller hand" med varandra, sa han.
"Mitt labb ville komma med en mer finkornig modell som uppskattade vad som var den mest sannolika uppsättningen av molekylära tillstånd för proteinerna och deras förmåga att hoppa mellan dessa tillstånd, som sedan skulle ge upphov till bilddata som Biteens labb skapade ", sa Freddolino.
"Att ha denna numeriska modell gör det möjligt för oss att göra beräkningsexperiment av vad som händer om proteinbindningen är dubbelt så snabb som vi tror. Tänk om den är 10 gånger så snabb som vi tror? Eller 10 gånger långsammare? Kan det fortfarande ge upphov till data? Mycket lyckligtvis kunde vi i det här fallet visa att de relevanta processerna verkligen fångades in i fluorescensmikroskopin."
Efter att ha identifierat de bindande egenskaperna hos naturlig Swi6, testade forskarna sina resultat genom att designa om Swi6 från dess komponenter för att se om de kunde replikera några av dess biokemiska egenskaper, sa Ragunathan. Detta gjorde det möjligt för forskarna att fastställa att avbildningen och modelleringen som utfördes i den första delen av artikeln återspeglar hur proteinet binder i sin naturliga miljö.
"Kan vi göra vad naturen gjorde under loppet av miljoner år och göra ett protein som på många sätt har egenskaper som liknar Swi6 i celler?" sa Ragunathan. "In vivo biokemi, som vi har bestämt oss för att kalla detta, var inte något som någonsin troddes vara möjligt inuti levande celler, men vi har visat att detta är fullt genomförbart genom att använda bildbehandling som en modalitet. Vi använder det här projektet som en grund för att förstå hur dessa epigenetiska tillstånd kan etableras och upprätthållas över generationer." + Utforska vidare
