Massproduktion av rekombinanta proteiner med användning av jästcells-"fabriker" kräver metanol, en förening som kräver säker hantering, medför risk att fatta eld och ibland producerar skadliga biprodukter. Forskare vid Institutionen för biokemi (BC), Indian Institute of Science (IISc), har nu utvecklat en alternativ säkrare process som istället förlitar sig på en vanlig livsmedelstillsats som kallas mono-natriumglutamat (MSG).
Rekombinanta proteiner, såsom vaccinantigener, insulin och monoklonala antikroppar, massproduceras genom att odla modifierade bakterie-, virus- eller däggdjursceller i stora bioreaktorer. Den mest använda organismen är jästen Pichia pastoris (nu kallad Komagataella phaffii). Den innehåller en unik promotor - en specifik genregion som kan aktiveras av metanol. Denna promotor kodar för ett enzym som kallas alkoholoxidas (AOX).
För att massproducera ett rekombinant protein skarvas genen som kodar för det proteinet in i jästgenomet precis bredvid AOX-promotorn. Jästcellerna matas sedan med glycerol eller glukos som kolkälla. När tillräckligt många celler har bildats tillsätts metanol, som sedan aktiverar AOX-promotorn, och cellerna börjar producera det rekombinanta proteinet i rikliga mängder.
De flesta industrier använder denna metanol-inducerade process för att producera rekombinanta proteiner. Metanol är dock mycket brandfarligt och farligt, vilket kräver stränga säkerhetsåtgärder, påpekar PN Rangarajan, professor vid BC och motsvarande författare till studien publicerad i Microbial Cell Factories . Metanol metaboliseras också för att bilda väteperoxid som kan inducera oxidativ stress i jästcellerna eller skada de rekombinanta proteinerna.
För att lösa detta problem, Trishna Dey, en före detta Ph.D. student vid BC, började leta efter alternativ. Efter en omfattande sökning fann teamet att mono-natriumglutamat (MSG), en livsmedelstillsats godkänd av USFDA, kan aktivera en annan promotor i jästgenomet som kodar för ett enzym som kallas fosfoenolpyruvatkarboxykinas (PEPCK). Aktivering av denna promotor med MSG ledde till proteinproduktion liknande metanolaktivering av AOX-promotorn.
Att optimera cellodlingsmediet för denna nya och oprövade process var utmanande, säger Neetu Rajak, första författare och Ph.D. student vid BC. Under lång tid växte jästcellerna dåligt i skakkolvar och producerade mycket lite rekombinant protein. "Det fanns en tid när vi nästan gav upp för att vi trodde att det inte skulle fungera", minns Rangarajan.
Gruppen insåg så småningom att det inte var tillräckligt att använda MSG enbart. Vedanth Bellad och Yash Sharma, projektassistenter på BC och medförfattare, förklarar att de försökte komplettera kulturen med olika andra föreningar, tills en till slut gjorde susen:etanol.
Tillsats av etanol hjälpte cellerna att växa snabbare, vilket ökade biomassan och mängden producerat rekombinant protein. Etanol är också säkrare för jästceller jämfört med metanol, eftersom det inte producerar giftiga biprodukter när det bryts ned.
För att testa sin process försökte teamet producera SARS-CoV-2-receptorbindningsdomänen - ett allmänt använt vaccinantigen som framgångsrikt har uttryckts i jäst- och däggdjursceller. De fann att deras nya expressionssystem producerade dubbelt så mycket antigen jämfört med den metanol-inducerade processen.
Forskarna hoppas att detta nya och inhemska uttryckssystem kan användas i biotekniska industrier för att massproducera värdefulla proteiner inklusive mjölk- och äggproteiner, barnmatstillskott och nutraceuticals, förutom terapeutiska molekyler.
Mer information: Neetu Rajak et al, Unlocking Nature's Toolbox:glutamat-inducerbar rekombinant proteinproduktion från Komagatella phaffii PEPCK-promotorn, Microbial Cell Factories (2024). DOI:10.1186/s12934-024-02340-1
Tillhandahålls av Indian Institute of Science
