Mikrofluidisk pre-polarisation NMR-inställning. (A) Jämförelse av statistisk och termisk polarisation av protoner i vatten som en funktion av detektionsvolym. Den rumstempererade vattenprotondensiteten är ρ =6,7 × 1028 m−3. (B) Prepolarisationskoncept. Analyten förpolariseras genom att den flödar genom en permanentmagnet (1,5-T Halbach-array). Den transporteras därefter till ett mikrofluidchip som är inrymt i en stabiliserad, lägre magnetfält (B0 =13 mT, Helmholtz-spolar) där den detekteras av NV NMR. (C) Detektionsinställning. Prepolariserad analyt flödar till ett mikrofluidchip där den stoppas via fluidomkopplare (visas ej), och NV NMR-signalen detekteras med hjälp av ett specialbyggt epifluorescensmikroskop med en numerisk apertur (NA) på ~0,8. En uppsättning av åtta gradientkompensationsspolar används för att eliminera första och andra ordningens magnetiska fältgradienter längs fältriktningen. Fältet stabiliseras temporärt med hjälp av en spolbaserad NMR-magnetometer i kombination med låginduktans återkopplingsspolar lindade runt de huvudsakliga Helmholtz-spolarna. (D) Installation av mikroflödeschip. Chipet är konstruerat med glas och lim. Två vätskeledningar passerar till detektionsområdet, en bestående av vatten (för NMR-spolmagnetometer) och den andra med analyt (för NV NMR). En radiofrekvens (RF) excitationsslinga, placerad mellan NMR-spolmagnetometern och NV NMR-sensorn, exciterar kärnspinnkoherens i båda kanalerna. NMR-spolmagnetometern består av en spole med en diameter på 3 mm lindad runt en vattenvolym på ~10 μl. RF-excitationsslingan och NMR-spolmagnetometern placerades ortogonalt mot varandra för att minimera överhörning. Kopparmikrovågsledningar (MW), tryckt på insidan av glasskivan, ger spinnkontroll över NV-elektronspinn. (E) NV NMR-geometri. Ett NV-dopat diamantmembran (1 mm gånger 1 mm gånger 0,035 mm) är placerat på ytan av en mikrofluidkanal (bredd:2 mm, höjd:mellan 0,2 mm och 1 mm) i kontakt med analyten. Laserbelysning (532 nm) studsar från den tryckta mikrovågslinjen, och fluorescens (650 till 800 nm) detekteras. Den effektiva analytdetekteringsvolymen är ~40 pl. Kredit:Science Advances, doi:10.1126/sciadv.aaw7895
Kvantsensorer baserade på kvävevakans (NV) centra i diamant är ett lovande detektionsläge för kärnmagnetisk resonansspektroskopi på grund av deras detekteringsvolym i mikronskala och icke-induktivt baserade provdetektionskrav. En utmaning som finns är att tillräckligt realisera hög spektral upplösning i kombination med koncentrationskänslighet för multidimensionell NMR-analys av pikoliterprovvolymer. I en ny rapport nu på Vetenskapens framsteg , Janis Smits och ett tvärvetenskapligt forskarteam på avdelningarna för högteknologiska material, Fysik och astronomi i USA och Lettland tog sig an utmaningen genom att rumsligt separera polarisations- och detektionsfaserna av experimentet i en mikrofluidisk plattform.
De realiserade en spektral upplösning på 0,65±0,05 Hz, en förbättring av storleksordningen jämfört med tidigare diamant NMR-studier. Med hjälp av plattformen, de utförde 2-D korrelationsspektroskopi av flytande analyter med en effektiv detektionsvolym på ~40 pikoliter. Forskargruppen använde diamantkvantsensorer som in-line mikrofluidiska NMR-detektorer i ett stort steg framåt för tillämpningar inom massbegränsad kemisk analys och encellsbiologi.
Kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopi är en kraftfull och väletablerad teknik för sammansättning, struktur- och funktionsanalys inom en mängd olika vetenskapliga discipliner. I konventionell NMR-spektrometri är signal-brusförhållandet (SNR) starkt beroende av den externa fältstyrkan (B 0 ). När spektralupplösningen ökade, B 0 ökade också, motiverar utvecklingen av allt större och dyrare supraledande magneter för förbättrad upplösning och SNR, vilket resulterat i en dubbelt ökad fältstyrka under de senaste 25 åren.
Dock, även med stort B 0 värden, detekteringen av mikroskalavolymer krävde ofta isotopmärkning, koncentrerade prover och långa experimentella tidslinjer. För att förbättra känsligheten för små provvolymer, forskare utvecklade induktiva spolar i miniatyr, vilket möjliggjorde flera framsteg, inklusive spektroskopi av äggceller och in vitro-diagnostik. De befintliga känslighets- och detektionsgränserna är ännu suboptimala för metabolisk analys av enstaka däggdjursceller eller för inkludering i in-line mikrofluidanalyser. Som en alternativ NMR-detektionsstrategi, kvantsensorer baserade på kvävevakans (NV) centra i diamant har dykt upp på grund av deras sub-mikrometer rumsliga upplösning och icke-induktiv baserad detektion.
Kärnväxelströmsmagnetfältprojektionsamplitud (integrerad över sensorvolymen) som en funktion av vattenvolymen. Den effektiva detektionsvolymen (~40 pL) definieras som volymen där den nukleära växelströmsfältprojektionsamplituden är lika med hälften av den från den totala effektiva provvolymen. Kredit:Science Advances, doi:10.1126/sciadv.aaw7895
Forskare har tidigare implementerat metoden för att upptäcka tidiga fluktuationer i nanoskala av kärnmagnetisering för att förbättra polariseringen. De använde viskösa lösningsmedel för att förbättra frekvensupplösningen till ~ 100 Hz för att få upplösningen av stora kemiska skift vid B 0 =3 T (Tesla). Även om ytterligare förbättringar i upplösning kan göras genom att öka detekteringsvolymen (V), de var till en kostnad för SNR. I detta arbete, Smits et al. rapportera en förbättring av storleksordningen i spektral upplösning för att uppnå en koncentrationskänslighet på ~ 27 M s 1/2 . För att uppnå detta, de separerade spatialt polarisations- och detektionsfaserna av experimentet i en mikrofluidisk uppsättning.
Forskargruppen använde starka permanentmagneter (1,5 Tesla) för att generera kärnspinnpolarisering och utförde detekteringen vid 13 mT med Helmholtz-spolar för att förenkla uppgiften att stabilisera NMR-linjebredder till nivåer under hertz. De underlättade användningen av diamantkvantsensorer som in-line mikrofluidiska NMR-detektorer vid låga mikrovågsfrekvenser. Förbättringarna gjorde det möjligt för Smits et al. att utföra tvådimensionell (2-D) korrelationsspektroskopi (COSY) av flytande analyter inom en effektiv detektionsvolym på ~ 40 pL (picoliter). Forskarna avser att kombinera denna plattform med framsteg inom dynamisk nukleär polarisering med hjälp av externa polariserande medel och potentiellt optisk hyperpolarisering med NV-centra för att möjliggöra NMR-spektroskopi av metaboliter vid fysiologiska koncentrationer vid rumslig upplösning i en cell.
I experimentuppställningen, Smits et al. innehöll vätskeanalyterna i en heliumtrycksatt behållare med varierande flödeshastigheter på upp till 50 µl/s. Uppehållstiden för analyterna var ungefär 6 sekunder, längre än spinrelaxationstiden för de studerade analyterna (till exempel T 1 för vatten ≈ 3s) vilket leder till en jämviktspolarisation på ~ 5x10 -6 . Analyten flödade sedan till ett detektionsområde för identifiering med NV NMR. För att utföra NV NMR-detektion, forskarna använde ett specialbyggt epifluorescensmikroskop och orienterade diamantmembran tillverkade i studien, på fyra möjliga NV-axlar för att passa in i det magnetiska fältet i uppställningen.
Karakterisering av förpolariserad NV NMR. (A) Den synkroniserade avläsningspulssekvensen. Den består av ett tåg av XY8-N-pulser som utför successiva fasmätningar av växelströmsmagnetfältet som produceras av bearbetningskärnor. Den uppmätta fluorescensen återspeglar en aliasversion av den nukleära växelströmsfältprojektionen. Hela sekvensen upprepas var 2,5 till 4,25 s (1,25 s för flöde och resten för detektion). (B) NV NMR-spektra (absolut värde av Fouriertransform) av vatten (röd) och ett applicerat 2,5-nT amplitudtestfält (blått) för en effektiv insamlingstid på 5,2 s (genomsnitt av 60 spår; total mättid, 150 s). NMR-signalamplituden som erhålls från den behandlade fotodetektorsignalen registreras i μV. Omvandlingen till magnetfältsamplitud (i nT) härleds från det kalibrerade testfältet. Infälld:SD för brusgolvet avslöjar aBmin =45 pT. Från dessa uppgifter, vi drar slutsatsen en minsta detekterbar koncentration på 27 M s1/2 (SNR =3). Inkluderar all experimentell dödtid, koncentrationskänsligheten är ~45 M s1/2. (C) Ett högupplöst NV NMR-spektrum av vatten (imaginär del av Fourier-transformen) avslöjar en full bredd vid halva maximala (FWHM) linjebredden på 0,65 ± 0,05 Hz. Data erhölls genom att i genomsnitt beräknade 60 spår, var 3 s lång. Kredit:Science Advances, doi:10.1126/sciadv.aaw7895
Smits et al. tillverkade mikrofluidchipet för att inrymma diamantsensorn, enheten innehöll ett kopparchip på en glasskiva för att leverera mikrovågorna. Forskarna inkluderade också en radiofrekvens (RF) excitationsslinga mellan diamanten och återkopplings-NMR-spolen, och en mikrofluidkanal som omsluter diamantsensorn och den kontaktande analyten. De konstruerade mikrofluidportar för att kombinera externa analytslangar i chipet och använde en laserstråle med en diameter på 20 µm för att excitera NV-centra genom ett 35 µm tjockt diamantmembran.
Forskargruppen applicerade därefter en serie XY8-5 mikrovågspulssekvenser till NV-centret för att detektera det nukleära växelströmsfältet. De använde avjoniserat vatten för att bestämma apparatens känslighet och spektrala upplösningsgränser. För att optimera spektralupplösningen, de justerade gradientkompensationsspolarna och demonstrerade förmågan hos NV NMR-spektrometern genom att erhålla proton-NMR-spektra av olika vätskeanalyter.
Till exempel, forskarna erhöll karakteristiska NV NMR-spektra för trimetylfosfat (TMP) och 1, 4-difluorbensen (DFB)-föreningar i studien. Efter att ha fastställt potentialen att detektera NMR-spektra med sub-hertz-upplösning och höga signal-brus-förhållanden (SNR) för de två föreningarna, de använde plattformen för att utföra 2D COSY NMR-spektroskopi. För detta, Smits et al. utförde två varianter av 2-D COSY-analysen för att undersöka nukleära interaktioner inom DFB (1, 4-difluorbensen) och utförde alla simuleringar med SPINACH-programpaketet för 2-D NMR.
ID NMR. Tidsdomän (vänster) och frekvensdomän (höger) NV NMR-signaler för (A) vatten, (B) trimetylfosfat (TMP), och (C) 1, 4-difluorbensen (DFB). Signalerna beräknades i medeltal över ~103 spår för ett totalt förvärv av ~1 timme. Ett bandpassfilter på ~1 kHz bandbredd appliceras på tidsdomändata för bättre visualisering. Frekvensdomänspektra visar Fouriertransformens imaginära komponent. Varje spektrum är anpassat med Gaussiska funktioner (svarta linjer). För TMP, vi begränsar bredden på båda linjerna till att vara lika med ett amplitudförhållande på 1:1 och finner JHP =11,04 ± 0,06 Hz. För DFB, vi begränsar bredden på alla tre linjerna till att vara lika med ett amplitudförhållande på 1:2:1 och finner JHF¯=6,09±0,05 Hz. Kredit:Science Advances, doi:10.1126/sciadv.aaw7895.
Den demonstrerade sub-hertz-upplösningen och flerdimensionella NMR-teknikerna kan bana väg för användningen av diamantkvantsensorer inom inline-avstavsanalys, encellig metabolomik och massbegränsad farmakodynamik. Smits et al. sträva efter den resulterande höga rumsliga upplösningen och epifluorescensformatet för att underlätta kemisk analys med hög genomströmning och NMR-avbildning av cellkulturer med encellsupplösning. Begränsningar för föreliggande anordning inkluderar de avsevärda medelvärdesberäkningstider som krävs vid fysiologiska koncentrationer som sträcker sig från mikromolar till millimolar volym. Forskarna föreslår att man använder högre magnetfält med längre och känsligare XY8-N mikrovågspulssekvenser för att förbättra NMR-känsligheten och fotonuppsamlingseffektiviteten i motsats till de befintliga metoderna. I längden, de förväntar sig att de största vinsterna i känslighet kommer att ske via icke-invasiva optiska hyperpolariseringsmetoder.
2D COSY NMR av DFB. (A) Homonukleär COSY-pulssekvens, (B) simulerat spektrum, och (C) experimentellt NV NMR-spektrum av DFB. (D) En modifierad heteronukleär COSY-sekvens avslöjar off-diagonala toppar i både (E) simulering och (F) experiment. Färgskalor motsvarar det normaliserade absoluta värdet av 2D Fourier-transformen. Vertikala axlar (f1 − fref) motsvarar frekvenserna för t1-dimensionen, och horisontella axlar (f2 − fref) motsvarar frekvenserna för t2-dimensionen. I (C), 14 värden på t1 i steg om 0,021 s upp till 0,294 s användes. Den totala anskaffningstiden var 22 timmar. I (F), 16 värden på t1 i steg om 0,021 s upp till 0,336 s användes. Den totala inhämtningstiden var 25 timmar. I båda fallen, t2-förvärvet sträckte sig från 0 till 1,25 s. Alla simuleringar utfördes med SPINACH-paketet. Simulerings- och experimentdata använder samma fönsterfunktioner. Kredit:Science Advances, doi:10.1126/sciadv.aaw7895.
Användningen av låg yttre fältstyrka (B 0 ) på 13 mT var en annan begränsning i studien eftersom den begränsade förmågan att lösa upp spektral splittring på grund av kemiska förskjutningar. Teamet strävar efter att förbättra den kemiska skiftupplösningen genom att öka B 0 till ~ 0,25 T, med användning av föreliggande detektionsschema. Dessutom, även om NMR-mikrofluidsensorn hade en effektiv detektionsvolym på ~40 pL, forskarna krävde flera milliliter analyt för att fylla det totala flödet av apparaten. Framtida mikrofluidchip kan därför antingen miniatyrisera eller utelämna förpolariseringssteg eller använda mindre mikrofluidiska kanaler för detektion i ett större fluidsystem.
På det här sättet, Janis Smits och medarbetare demonstrerade användningen av diamantkvantsensorer för mikrofluidiska NMR-tillämpningar. De visade att separering av polarisations- och detektionsstegen möjliggjorde en förbättring av storleksordningen i spektral upplösning jämfört med befintliga diamant-NMR-studier. Forskarna validerade plattformen genom att utföra 2D NMR på vätskeanalyter och föreslår dess framtida tillämpningar inom multidisciplinära forskningsfält.
© 2019 Science X Network
