Ett stort samarbete som har utvecklats under de senaste tre åren mellan ASU och europeiska forskare, har resulterat i ett betydande tekniskt framsteg i röntgenkristallografiska provstrategier.

ASU -bidraget kommer från School of Molecular Sciences (SMS), fysiska institutionen och Biodesign Institute Center for Applied Structural Discovery.

Den europeiska röntgenfria elektronlasern (EuXFEL) är en forskningsanläggning för superlativer:Den genererar ultrakorte röntgenpulser — 27, 000 gånger per sekund och med en briljans som är en miljard gånger högre än för de bästa konventionella röntgenstrålningskällorna. Efter tio års konstruktion, det öppnade för första experiment i slutet av 2017. Gruppen av Alexandra Ros, professor i ASU:s SMS tilldelades den andra tilldelningen av stråltid bland konkurrenter över hela världen.

Deras resultat, publicerad 9 september i Naturkommunikation , validerade en unik mikrofluidisk droppgenerator för att minska såväl provstorlek som avfall (som kan vara så högt som 99 procent) i hennes teams experiment med Serial Femtosecond Crystallography (SFX). Med hjälp av detta, de bestämde kristallstrukturen för enzymet 3-Deoxy-d-manno-Octulosonate 8-Phosphate Synthase (KDO8PS) och avslöjade ny detalj i en tidigare odefinierad slingregion av enzymet som är ett potentiellt mål för antibiotikastudier.

"Vi är glada över att detta arbete, till följd av ett stort samarbete, har mottagits väl i XFEL -gemenskapen, "förklarade Ros." Vi utvecklar denna metod ytterligare och söker synkronisering av mikrofluidiska droppar med pulserna av XFEL. Just nu, ett litet team av ASU -studenter har just avslutat experiment på Linac Coherent Light Source (LCLS) vid SLAC National Accelerator Laboratory i Menlo Park, CA för att förfina metoden. Det kunde inte ha varit bättre tidpunkt för publicering av vårt arbete. "

SLAC har varit den XFEL-anläggning som är mest känd för amerikanska forskare där det nu berömda arbetet med kristallografi av proteinnanokrystaller (av ASU-teamet ledd av professorerna John Spence och Petra Fromme) utfördes. SLAC och dess följeslagare i Europa, även i Hamburg, har varit mycket framgångsrika och följaktligen har blivit kraftigt överbokade. Den nya anläggningens kommande on-line, med sin gigantiska 2,6-mils acceleratortunnel och upplösning av atomlängden, har avlastat en del av efterfrågan på de andra anläggningarna, samtidigt som det erbjuder stora nya möjligheter inom fysik.

SFX är en lovande teknik för bestämning av proteinstruktur, där en flytande ström innehållande proteinkristaller skärs med en högintensiv XFEL-stråle som är en miljard gånger ljusare än traditionella synkrotronröntgenkällor.

Även om kristallerna förstörs av den intensiva XFEL -strålen omedelbart efter att de har diffrakterat, diffraktionsinformationen kan, anmärkningsvärt, fortfarande spelas in tack vare de toppmoderna detektorerna. Kraftfulla nya dataanalysmetoder har utvecklats, tillåter ett team att analysera dessa diffraktionsmönster och erhålla elektrontäthetskartor och detaljerad strukturell information om proteiner.

Metoden är särskilt tilltalande för svårkristalliserade proteiner, såsom membranproteiner, eftersom det ger strukturuppgifter med hög upplösning från mikro- och till och med nanokristaller, vilket minskar bidraget från kristalldefekter och undviker den tråkiga (om inte omöjliga) tillväxten av de stora kristaller som traditionell synkrotronbaserad kristallografi kräver.

Medan kristallografi med XFEL har varit en kraftfull teknik för att riva upp strukturerna i stora proteinkomplex och även tillåta tidsupplöst kristallografi, denna banbrytande vetenskap skapar ändå ett stort problem. På grund av den lilla "träff" -frekvensen krävs det enorma mängder suspenderat protein, som även om den inte är bestrålad, är besvärliga att hämta för de flesta proteinprover. Så mycket som 99% av proteinet kan slösas bort.

Här ligger det stora tekniska framsteg som Ros och hennes team gjort. De har utvecklat en 3D-tryckt mikrofluidisk enhet, som är högupplöst, och genererar vatten-i-olja-droppar med variabel droppsegmentering som kan synkroniseras med de fria elektronlaserpulserna. Detta minskar dramatiskt mängden renat protein som behövs för det europeiska XFEL -experimentet från det för närvarande typiska (och nästan otillgängliga) kravet på 1 g för fullständig datauppsättning.

Betydelsen av denna utveckling måste återges. Forskarnas tillvägagångssätt blandar prov-laddade flytande "sniglar" i en offervätska, så att en flytande mikrostråle som rör sig snabbt upprätthålls med provet närvarande endast under exponering för femtosekund XFEL-pulserna (en miljonedel av en miljarddel av en sekund i varaktighet).

Forskargruppen har visat droppgenerering av enzymet KDO8PS kristallsuspensioner med mikrofluidiska droppgeneratorn och visat att droppgenereringsfrekvensen kan styras av hastigheterna för vatten- och oljeströmmarna. Diffraktionskvaliteten för kristallerna i KDO8PS är liknande både när de injiceras i vattenhaltiga droppar omgiven av olja eller genom kontinuerlig injektion med ett Gas Dynamic Virtual Nozzle (GDVN), med ~ 60% minskning av provkonsumtion uppnådd med droppinjektion.

Den bestämda strukturen avslöjade ny detalj i ett tidigare odefinierat loopområde för KDO8PS, ett potentiellt mål för antibiotikastudier. Dessa resultat förespråkar framtida rutinmässig integration av droppgenerering genom segmenterat oljeflöde vid andra XFEL -enheter runt om i världen.