Konfokala fluorescensbilder av glasytor belagda med cyaninfärgämnena Alexa Fluor 647 (a) och CF660C (b) och med carborhodamine färgämne ATTO647N (c) efter ljusexcitation vid 568 nanometer (nm). Genom att excitera de rödabsorberande färgämnena vid 640 nm i vissa områden (negativa bilder uppe till höger), färgämnen fotokonverteras där och det är möjligt att skriva bokstäver på ytan som exciterades vid 568 nm och fluorescerar vid ca 580 nm. Karborhodaminfärgämnet visar mer effektiv fotoblåsning än cyaninfärgerna. Kredit:Team Markus Sauer / University of Würzburg
Den senaste utvecklingen inom fluorescensmikroskopi gör det möjligt att avbilda enskilda molekyler i celler eller molekylära komplex med en rumslig upplösning på upp till 20 nanometer. Dock, under vissa omständigheter, en effekt uppstår som förfalskar resultaten:laserljuset som används kan orsaka att mycket reaktiva syremolekyler bildas i provet. Dessa kan sedan skada de fluorescerande färgämnena som används i sådan utsträckning att de inte längre fluorescerar. Bland mikroskopexperter, denna effekt är känd som fotoblekning.
Dock, olika fluorescerande färgämnen kan också omvandlas genom fotoblekning så att de absorberar ljus med kortare våglängder. "Ett tidigare rött fluorescerande färgämne lyser sedan grönt. Dess fluorescens har förskjutits mot det blå intervallet på våglängdsskalan. Det är därför denna effekt kallas photoblueing, " förklarar professor Markus Sauer, en expert på superupplösningsmikroskopi från Biocentret Julius-Maximilians-Universität Würzburg (JMU) i Bayern, Tyskland.
Första exakta beskrivningen av photoblueing
Sauers team presenterar nu den exakta molekylära mekanismen för fotoblåning för cyaninfärgämnen som Cy5 för första gången i tidskriften Naturmetoder . Dr Martin Schnermann från Center for Cancer Research i Frederick (USA) är också involverad i publiceringen.
"Eftersom vi förstod mekanismen så exakt, vi kunde förhindra fotoblåsning med enkla tillsatser som vitamin C eller öka den genom att tillsätta en sorts katalysator, säger Markus Sauer.
Att förhindra photoblueing kan vara ganska viktigt. Även om effekten bara kan påverka några få procent av färgämnet som används, det kan ändå leda till fel eller feltolkningar av mikroskopin, till exempel i energiöverföringsexperiment (FRET). Detta beror på att de omvandlade färgämnena detekteras med samma höga känslighet som utgångsprodukterna.
Enkla buffertar förhindrar fotoblåsning
"Våra resultat visar vilka färgämnen som påverkas och hur fotoblåsning kan förhindras genom enkla bufferttillsatser, Sauer säger, angående innehållet i Naturmetoder papper. "Men de visar likaväl hur photoblueing möjligen med fördel kan användas för fluorescensavbildning och för att spåra singel, specifikt omvandlade färgämnesmolekyler."
Det är precis vad Sauers team planerar att ta itu med härnäst:Photoblueing ska vidareutvecklas för, bland annat, målinriktad spårning av enskilda bakteriella och virala partiklar i infektionsprocesser. Arbetet som beskrivs här finansierades av den tyska forskningsstiftelsen DFG.
