När man tittar på biologiska prover med ett mikroskop störs ljusstrålen om objektivets lins är i ett annat medium än provet. Till exempel, när man tittar på ett vattnigt prov med en lins omgiven av luft, böjs ljusstrålarna skarpare i luften runt linsen än i vattnet.
Denna störning leder till att det uppmätta djupet i provet är mindre än det faktiska djupet. Som ett resultat verkar provet tillplattat.
"Det här problemet har varit känt under lång tid, och sedan 80-talet har teorier utvecklats för att fastställa en korrigeringsfaktor för att bestämma djupet. Alla dessa teorier antog dock att denna faktor var konstant, oavsett provets djup. Detta skedde trots att den senare Nobelpristagaren Stefan Hell på 90-talet påpekade att denna skalning kunde vara djupberoende", förklarar docent Jacob Hoogenboom från Delfts tekniska universitet.
Sergey Loginov, en före detta postdoc vid Delfts tekniska universitet, har nu visat med beräkningar och en matematisk modell att provet verkligen verkar starkare tillplattat närmare linsen än längre bort. Ph.D. kandidat Daan Boltje och postdoc Ernest van der Wee bekräftade därefter i labbet att den korrigerande faktorn är djupberoende.
Verket publiceras i tidskriften Optica .
Senaste författaren Ernest Van der Wee säger:"Vi har sammanställt våra resultat till ett webbverktyg och programvara som medföljer artikeln. Med dessa verktyg kan vem som helst bestämma den exakta korrigeringsfaktorn för sitt experiment."
"Delvis tack vare vårt beräkningsverktyg kan vi nu mycket exakt skära ut ett protein och dess omgivning från ett biologiskt system för att bestämma strukturen med elektronmikroskopi. Den här typen av mikroskopi är mycket komplex, tidskrävande och otroligt dyr. Att säkerställa att att du tittar på rätt struktur är därför mycket viktigt, säger forskaren Daan Boltje.
"Med vår mer exakta djupbestämning behöver vi spendera mycket mindre tid och pengar på prover som har missat det biologiska målet. I slutändan kan vi studera mer relevanta proteiner och biologiska strukturer. Och bestämma den exakta strukturen av ett protein i ett biologiskt system är avgörande för att förstå och i slutändan bekämpa abnormiteter och sjukdomar."
I det medföljande webbverktyget kan du fylla i relevanta detaljer för ditt experiment, såsom brytningsindex, objektivets bländarvinkel och våglängden på det använda ljuset. Verktyget visar sedan kurvan för den djupberoende skalfaktorn. Du kan också exportera denna data för eget bruk. Dessutom kan du plotta resultatet i kombination med resultatet av var och en av de befintliga teorierna.
Mer information: Sergey Loginov et al, Djupberoende skalning av axiella avstånd i ljusmikroskopi, Optica (2024). DOI:10.1364/OPTICA.520595
Journalinformation: Optica
Tillhandahålls av Delft University of Technology
