Forskning publicerad denna vecka i JACS ( Journal of the American Chemical Society ) visar kontinuerlig och kontrollerad translokation av en enkelsträngad DNA (ssDNA) polymer genom en protein nanopore av ett DNA-polymerasenzym. Uppsatsen av forskare vid University of California Santa Cruz (UCSC) ger grunden för en molekylär motor, en viktig komponent i Strand Sequencing med nanoporer. Forskare vid UCSC samarbetar med det brittiska företaget Oxford Nanopore Technologies, utvecklare av en nanopore DNA-sekvenseringsteknologi.
Den nya forskningen främjar tidigare arbete som visar att DNA kunde flyttas genom en nanopore med hjälp av ett polymeras. DNA-rörelse i den tidigare studien utfördes av en serie polymeraser och krävde komplex elektronik för kontroll. Förbättringar som noteras i JACS-dokumentet inkluderar tekniker för att tillåta kontinuerlig ssDNA-rörelse, ger en oavbruten signal när strängen flyttades genom nanoporen i realtid. Enzymet-nanopore-konstruktionen var aktiv och mätbar i ett konstant elektroniskt fält utan komplex elektronik.
Kontrollerad initiering av polymerasbehandlingen vid platsen för nanopor-enzymkomplexet möjliggjorde sekventiell mätning av flera ssDNA-molekyler med en enda experimentell uppsättning. Dessutom uppvisade polymeraset en ihärdig bindning med DNA-polymeren, till skillnad från tidigare enzymer som undersökts under liknande förhållanden. Dessa resultat visar att egenskaperna hos phi29 DNA-polymeraset står i proportion till en strängsekvenseringsteknologi.
I "strängsekvenseringsmetoden" för nanopore DNA-sekvensering, jonström genom ett protein nanopore mäts och strömavbrott används för att identifiera baser på en ssDNA-polymer i sekvens, eftersom det translokerar porerna. Två viktiga utmaningar för denna metod är:att konstruera en nanopore för att möjliggöra identifiering av individuella baser när en ssDNA-polymer spänner över poren och en mekanism för att kontrollera translokation av ssDNA med en konsekvent och lämplig hastighet för att möjliggöra basidentifiering genom elektroniska mätningar. Translokationstekniker som beskrivs i denna artikel är kompatibla med basidentifieringsteknik som utförs i laboratorierna hos Oxford Nanopore Technologies och dess samarbetspartners.
"Detta arbete med phi29-polymeraset har gjort det möjligt för oss att göra viktiga framsteg när det gäller ett nyckelelement i DNA-strängssekvensering, " sa utredaren professor Mark Akeson vid University of California, Santa Cruz. "Medan tidigare arbete visade att translokationskontroll var möjlig i teorin, detta arbete visar att DNA-translokationskontroll är möjlig under förhållanden som är kompatibla med en elektronisk sekvenseringsteknologi. Vi ser fram emot ytterligare samarbete med Oxford Nanopore för att förverkliga denna forskning."
"Strängsekvenseringsmetoden för DNA-sekvensering med en nanopore har studerats i många år, men den här artikeln visar för första gången att DNA kan translokeras av ett enzym med metoder som är förenliga med en elektronisk teknologi med hög genomströmning, sa Dr Gordon Sanghera, VD för Oxford Nanopore. "Vi är glada över detta arbete och dess potential i kombination med ytterligare nya utvecklingar inom DNA-basidentifiering på DNA-strängar, det andra kritiska elementet för strängsekvensering."
