Ett innovativt tillvägagångssätt för att kalibrera högteknologiska mikroskop gör det möjligt för forskare att spåra rörelsen av enskilda molekyler i 3D på nanoskala.
En forskargrupp från Stanford University, ledd av W. E. Moerner, förlänger arbetet som gav Moerner och kollegorna Eric Betzig och Stefan W. Hell 2014 års Nobelpris i kemi. Betzig och Moerner var pionjärer i utvecklingen av superupplöst bildbehandling, som bröt diffraktionsgränsen för optisk mikroskopi genom att använda fluorescensen av enstaka molekyler för första gången. Det nya verket, publicerad i The Optical Society's high impact journal Optica , visar en markant förbättring av noggrannheten hos denna avbildningsteknik och för att spåra molekyler i tre dimensioner.
Spåra hur molekyler rör sig, forma former och interagera inom kroppens celler och neuroner erbjuder en kraftfull ny syn på viktiga biologiska processer som signalering, celldelning och neuronkommunikation, som alla påverkar människors hälsa och mottaglighet för sjukdomar.
Utnyttja en transformation i mikroskopi
Superupplösningsmikroskopi använder lasrar för att excitera fluorescens från enstaka molekyler under förhållanden där endast ett fåtal sänder ut åt gången, övervinna den traditionella upplösningsgränsen för optisk mikroskopi satt av ljusets diffraktionsgräns.
"Med tillkomsten av superupplöst bildbehandling, vi förbättrade upplösningen med en faktor 5 till 10 bortom diffraktionsgränsen – från 200 nanometer ner till 40 eller till och med 10 nanometer, " sade Moerner. "Denna nya värld med kraftigt ökad upplösning medför en stor förändring i hur det optiska systemet fungerar."
Dock, Tidigare kalibreringstekniker för superupplösningsmikroskopi var inte tillräckligt exakta för 3D-mätningar av enstaka molekyler. Den nya kalibreringsmetoden använder en nanohålsuppsättning för att korrigera för optiska förvrängningar över ett bredfältsmikroskops hela synfält.
Att hantera distorsion
Vid avbildning i skalan av enskilda molekyler, en enda ljuspunkt som kommer från en molekyl kan vanligtvis lokaliseras med cirka 10 nanometers precision. Vid så höga upplösningar, alla små brister i ett optiskt system introducerar bildförvrängningar, eller aberrationer, som kan avsevärt skeva mätningar, speciellt i 3D. De resulterande felen kan betyda skillnaden mellan att tolka två molekyler som interagerande eller helt enkelt vara nära varandra.
Medan många använder fluorescerande pärlor för att kalibrera 3D-mikroskop, Alex von Diezmann, doktorand vid Moerner Lab, Stanford University, tog ett annat tillvägagångssätt. Han skapade en rad hål i en metallfilm, var och en är mindre än 200 nanometer och regelbundet placerad med 2,5 mikron från varandra, att använda som en 3D-kalibreringsstandard. När hålen väl fylldes med fluorescerande färgämnen, arrayen kan användas för att kalibrera för optiska fel över hela mikroskopets synfält, inte bara på ett fåtal utvalda platser, som är möjligt med fluorescerande pärlor. Genom att använda denna teknik, forskarna kunde korrigera aberrationer på 50-100 nanometer till bara 25 nanometer.
"Innan detta, människor hade inte uttryckligen oroat sig för dessa avvikelser, " sa von Diezmann. "Det faktum att vi visade förekomsten av fältberoende aberrationer, och visade att de kunde försämra bilder, är en viktig del av detta arbete."
Forskarna studerade den nya kalibreringstekniken med dubbelhelix och astigmatisk punktspridningsfunktioner, två typer av optisk modifiering som vanligtvis används för att extrahera z-axelposition. Även om båda punktspridningsfunktionerna visade z-axelrelaterade felaktigheter som skapade cirka 20 procents fel i 3D-mätningarna, forskarna korrigerade dessa avvikelser med hjälp av 3D nanohole array.
Visa fördelar för studier av proteiner i bakterier
Forskarna tillämpar nu den nya 3D-kalibreringstekniken på alla sina enmolekylära spårning och superupplösningsmikroskopistudier. Till exempel, von Diezmann använder den för att studera proteinlokalisering i bakterier som bara mäter två mikron i längd. Med 3D-kalibreringstekniken, han kan noggrant mäta och spåra nyckelsignalproteiner i nanodomäner som bara är 150 till 200 nanometer stora.
Forskarna påpekar att korrigering av fältberoende och andra typer av avvikelser blir allt viktigare i takt med att optiska mikroskopitekniker utvecklas för att avbilda djupare in i celler, till exempel.
"Vi studerade detta tillvägagångssätt för ett par fall, men den kan användas med vilken superupplösning eller lokaliseringsmikroskop som helst som kräver riktigt exakta 3D-mätningar, ", sa von Diezmann. "Det kommer att bli spännande att se andra grupper använda det för att ta reda på hur deras speciella teknik påverkas av fältberoende aberrationer. Som en gemenskap, kanske kan vi hitta ännu bättre sätt att hantera dessa aberrationer."
Forskare producerade ett 3D-kalibreringsverktyg genom att skapa en rad hål i nanoskala fyllda med fluorescerande färgämne. I en), bredfältsbelysning (grön) passerar genom glastäckglaset till ett nanohål etsat i ett lager av aluminium. Lösningen av fluorescerande färg fyller hålen, och de resulterande ljuspunkterna (orange) detekteras underifrån. Figur (b) visar en svepelektronmikroskopbild av hålen, which are each 200 nanometers or less in diameter.
