Forskare från Harvard Medical School har förbättrat designen av små nanoskivor – syntetiska modeller av cellmembran som används för att studera proteiner som styr vad som kommer in i och lämnar en cell. Förbättringarna ger en oöverträffad bild av hur virus infekterar celler.

De nya nanodskivorna är mer stabila än tidigare versioner och, för första gången, kan göras i flera exakta storlekar och former.

"Vi har äntligen en definierad miljö där vi kan studera hur virus eller andra proteiner interagerar med membranproteiner och få detaljer som aldrig sett förut, sa Gerhard Wagner, Elkan Blout professor i biologisk kemi och molekylär farmakologi vid HMS och senior författare till studien.

Designförbättringarna innebär att forskare nu kan titta under ett mikroskop som virus – i det här fallet, poliovirus – docka med nanoskivorna, öppna en por och injicera deras genetiska material.

"Ett av huvudmålen inom virologi är att steg för steg förstå hur virus kommer in i celler och att göra en "molekylär film", ", sa första författaren Mahmoud Nasr, en forskare i Wagnerlabbet. "Förhoppningen är att dessa nanoskivor kommer att hjälpa oss att samla in mer detaljer om denna process så att vi kan designa vacciner och småmolekylära läkemedel för att förbjuda virusinträde."

Dessutom, Att bädda in olika proteiner i nanoskivorna och tumla runt dem i kärnmagnetiska resonansspektrometrar (NMR) ger skarpare bilder av proteinernas strukturer och dynamik än vad som tidigare varit möjligt, hjälpa forskare att bättre förstå proteinernas funktioner i kroppen.

Fynden rapporterades i Naturmetoder den 21 nov.

Spänna bältet

Så kallade fosfolipid-nanoskivor med två lager är i grunden buntar av fett som kläms runt midjan av ett par proteinbälten. Fetterna, eller lipider, bildar ett dubbelt lager som det naturliga cellmembranet. Forskare kan sedan bädda in membranproteiner i dubbelskiktet.

Nanoskivor dök upp i början av 2000-talet som ett alternativ till andra membransurrogat som är överdimensionerade eller instabila eller som kräver rengöringsmedel, som stör naturlig proteindynamik. Men nanoskivor presenterade sina egna problem. Till exempel, forskare kunde inte göra dem i konsekventa storlekar, kastar av sig testresultat.

Wagners team insåg att problemet troligen låg i det faktum att proteinbältena som omgav nanodskivorna öppnade sig, så att skivorna svällde med ojämna mängder lipid.

Säker nog, när forskarna gjorde lite tjusig kemi för att spänna bältena, nanoskivorna kom ut i ett mycket smalare storleksintervall. Skivorna höll också ihop bättre över tid och vid de höga temperaturer som krävs för NMR-experiment.

Forskarna fann att de kunde förkorta eller förlänga bältena och ändå stänga dem, så att nanoskivorna kan anpassas till specifika membranproteiner. Än så länge, de har gjort skivor med diametrar på 9, 11, 15 och 50 nanometer.

Att kunna kontrollera storleken på nanoskivor utökar verktygens användbarhet för en rad proteiner och teknologier. NMR kräver små skivor och proteiner, till exempel, medan elektronmikroskopi ofta behöver stora.

"Du kan inte använda små nanoskivor för att studera enorma proteinkomplex eller för att titta på virus, som behöver en minimal yta för att bilda en por, sa Nasr.

De flesta nanoskivorna är cirkulära, även om forskarna också pysslar med en rad polygonala former, från trianglar till hexagoner.

"Vi hoppas att genom att packa ihop mer effektivt än cirkulära nanoskivor, de polygonala nanoskivorna, speciellt om vi kan göra mindre, kommer att hjälpa oss att växa bra kristaller, vilket ger oss ett annat sätt att lösa strukturerna hos membranproteinerna vi bäddar in i dem, sa Nasr.

Viral sökare

I korridoren från Wagners labb, James Hogle, Edward S. Harkness professor i biologisk kemi och molekylär farmakologi vid HMS, och hans postdoktor Mike Strauss stötte på vägspärrar för att försöka lära sig hur enkla virus, såsom poliovirus, komma in i cellerna.

"Något måste gå över membranet, ", sa Hogle. Det fanns några bevis för att poliovirus öppnade porer i membranet och skickade bara deras genetiska material igenom, men modellsystemen som forskarna använde, kallas liposomer, var för oregelbundna och instabila för att visa vad som hände i membranet.

"Vi kunde inte se de bitar vi var intresserade av, sa Hogle.

Ivriga att ta reda på om de modifierade nanoskivorna gav en bättre vy, Hogle och Strauss slog sig ihop med Wagner och Nasr.

Först, Nasr byggde 50 nanometerskivor som var tillräckligt stora för att rymma alla pusselbitar. Sedan bäddade teamet in proteiner i nanoskivorna som binder till poliovirus, tillsatt polioviruspartiklar till blandningen, frös in proverna och tog ögonblicksbilder genom ett kryo-elektronmikroskop.

"Vi frågade viruset, "Kom fäst vid nanodskivan, gå in i cellen och visa oss vad du gör, '" förklarade Nasr.

Bilderna visade några viruspartiklar som tog betet – fäster vid receptorproteinerna, öppna vad som såg ut som porer genom lipiddubbelskiktet och frigöra deras RNA som om de försökte infektera en riktig cell.

"Ingen hade sett en sådan por förut, sa Nasr.

Forskarna har ännu inte bekräftat att föremålen de ser verkligen är porer, men, Hogle sa, "Vi vet att de är där eftersom RNA:t går över."

"De ser verkligen ut som porer, " tillade han. "Som de säger, "Om den går som en anka, och kvacksalvare som en anka...'"

Nasr försöker nu göra ännu bättre skräddarsydda 30-nanometerskivor för att hjälpa Hogles team att fastställa strukturen av poliovirus/receptorproteinkomplexet och gräva vidare i vad som händer i membranet.

"Nanoskivorna är en spännande teknik, " sa Hogle. "Jag kan inte föreställa mig något annat sätt att se hur poren ser ut. Mahmoud var väldigt smart att få dessa att fungera och skapa ett system som öppnar dörren för en mängd olika studier."

Forskarna hoppas att deras första resultat uppmuntrar andra att använda nanoskivorna för att granska många virus/receptorinteraktioner. Redan översvämmad av förfrågningar om samarbete, Wagners grupp har gjort en samling av proteinbälten tillgänglig och publicerar ett detaljerat protokoll så att andra labb kan bygga nanoskivorna på egen hand.

Strukturdetalj

Utöver att studera viral inträde, Wagners team visade att nanoskivorna kan förbättra NMR-resultat och tillåta att fler membranproteiner studeras med hjälp av NMR. Dessa inkluderar G-proteinkopplade receptorer, som cirka 40 procent av dagens läkemedel är utformade för att rikta in sig på.

"Med denna teknik, vi kan få fantastiska spektra, sa Wagner.

Eftersom nanoskivorna inte bryts ner vid höga temperaturer, "vi kan göra NMR-experiment i veckor, och GPCR:erna försämras inte, sa Nasr.

Nanoskivorna verkar också stabilisera proteinerna som är inbäddade i dem.

"De är mycket resistenta mot proteinskärande enzymer som går in och attackerar dem, sa Wagner.